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【技术实现步骤摘要】
本申请涉及狂犬病疫苗,具体涉及一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法和应用。
技术介绍
1、人二倍体细胞是指由受精卵发育而来,且体细胞中含有两个染色体组的细胞。人二倍体细胞来源于人体组织,是已经公知的可用于制备病毒疫苗的宿主细胞,其用于制备疫苗时细胞内的残余成分通常不会成为超敏反应原,因此其对应制得的疫苗的安全性相对较高。
2、目前,在人二倍体细胞制备狂犬病疫苗生产中,通常使用含10%左右血清的基础mem培养基培养扩增细胞。血清能为细胞提供生存和增殖所必需的生长因子、细胞贴壁和铺展的基质成分、载体蛋白和中和毒性的物质,也为培养液提供良好的缓冲体系及蛋白酶抑制剂等,由此促使人二倍体细胞能够有效增殖。
3、然而,血清中的成分复杂且有些还难以明确,因此使用血清培养收获的人二倍体细胞存在着外源病毒等致病因子污染风险,再加上血清来源易受市场因素影响,这就容易导致批次间容易产生较大差异,使细胞培养标准化和产品纯化难度加大,疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险也始终存在。
技术实现思路
1、为了减小疫苗生产批次间差异,本申请提供一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法和应用,本申请采用培养方式与特定的无血清细胞培养液的配合,其在保证疫苗产量的情况下能够有效降低批次间的差异,有助于人二倍体细胞培养标准化,降低产品纯化难度和安全风险。
2、第一方面,本申请提供一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法,包括以下步骤:
3、细
4、细胞培养:将细胞扩增后的单层细胞用无血清细胞液制成细胞悬液,细胞密度控制在5.0×105个/ml-7.0×105个/ml,再将获得的细胞悬液接种于培养容器中用无血清细胞培养液继续培养,控制在25±2℃的温度下细胞吸附3-4h;控制搅拌速度70-80rpm、温度37±2℃、ph值7.1-7.3、do值40-60%的参数条件下培养;
5、所述无血清细胞培养液包括以下组分:
6、基础mem培养基4.7~8.0g/l,199培养基2.0~8.8g/l,l-谷氨酰胺0.5~0.6g/l,碳酸氢钠0.8~1.2g/l,人表皮生长因子2~4μg/l,胰岛素10~20mg/l,海藻糖1~2g/l。
7、在狂犬病疫苗用人二倍体细胞的培养过程中,需要先将细胞扩增到一定数量后再进一步培养;其中的扩增数量过少容易造成细胞难以快速进行贴壁,使得细胞培养的效率较低;若扩增的数量过多,其中扩增的细胞会存在较多凋亡的情况;因此本申请严格控制细胞扩增以及细胞培养过程中的细胞密度。由此本申请能够收获高活性且适于有效贴壁生长的细胞,随后再控制适宜的培养温度、搅拌速度、ph、do值以及培养时间,为细胞培养提高适宜的生长环境。
8、在此基础上,本申请还严格控制无血清细胞培养液的组分配比,这是基于申请人在实际生产中发现,虽然199培养基是一款比较成熟的无血清细胞培养液,但是其在狂犬病疫苗制备的实际应用过程中,199培养基不适宜人二倍体细胞增殖,细胞易凋亡,病毒产量低。为此,申请人在基础mem培养基的基础上添加了199培养基,基础mem培养基是贴壁细胞培养中常用的培养液之一,申请人发现将两种细胞培养液按设定量配置再添加一定量l-谷氨酰胺、碳酸氢钠、人表皮生长因子、胰岛素和海藻糖后的新培养液的培养效果明显优于仅使用其中一种的培养效果,这可能是由于基础mem培养基的加入使得199培养基的营养物质被稀释,同时又补足了细胞生长增殖多所需的元素,进而使得人二倍体细胞能相对平缓地进行增殖,在这个过程中,人二倍体细胞能有效吸收其中的营养物质,为细胞感染病毒后产生抗原做好准备工作。
9、另外结合人表皮生长因子能促进细胞分裂、在各种细胞系中引发细胞有丝分裂,在组织培养中可用于减少或消除对血清的需求、并可与其他培养液添加剂和激素一起使用的特点,再配合胰岛素具有调节脂肪和蛋白质的代谢以及促进细胞生长等特点,因此本申请通过添加人表皮生长因子和胰岛素来促进细胞的进一步贴附和增殖;碳酸氢钠则可以稳定培养液的ph,而l-谷氨酰胺能进一步对199培养基进行营养补充,由此为细胞扩增提供充足的养分。
10、虽然海藻糖在疫苗领域中通常用作冻干保护剂,其能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜,有效地保护生物分子结构不被破坏,维持生命体的生命过程和生物特征。但在本申请中,海藻糖在保护细胞的同时还能与l-谷氨酰胺配合收获收率更高的产品,这可能是由于海藻糖促使细胞保持良好的生物活性以促使细胞更好地吸收营养物质,而l-谷氨酰胺能进一步对199培养基进行营养补充,由此为细胞扩增提供充足的养分。
11、另外,申请人经过大量实验验证发现,当l-谷氨酰胺含量为0.5~0.6g/l、碳酸氢钠0.8~1.2g/l、人表皮生长因子含量为2~4μg/l、胰岛素含量为10~20μg/ml、海藻糖1~2g/l时,该培养液培养的人二倍体细胞的产品收率更高,因此本申请要保证无血清的培养效果,上述组分以及对应的添加量是关键参数之一。
12、综上,本申请通过严格控制细胞增殖和细胞培养中的具体参数,再配合特定的无血清细胞培养液,由此能在保证疫苗产量的情况下有效降低批次间的差异,有助于人二倍体细胞培养标准化,降低产品纯化难度和安全风险。
13、优选的,所述基础mem培养基和所述199培养基的重量比为5:5-8:2。
14、优选的,所述无血清细胞培养液的ph为6.8-7.0。
15、通过采用上述技术方案,本申请进一步限定基础mem培养基和199培养基的重量比为5:5-8:2,无血清细胞培养液的ph为6.8-7.0,该无血清细胞培养液对应培养的人二倍体细胞在相同培养时间内细胞存活率明显高于其他比例配制的培养液,其最终收获的产品收率也相对较高。
16、优选的,所述l-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:2-3。
17、申请人经过大量实验验证发现,当l-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:2-3时,该培养液培养的人二倍体细胞的产品收率更高,因此将其作为进一步优选。
18、优选的,所述人二倍体细胞为mrc-5细胞。
19、本申请的无血清细胞培养液可以适用于2bs细胞、mrc-5细胞、kmb17细胞等细胞培养,其中本申请对mrc-5细胞的培养效果更优,能够收获收率更高的产品,因此将其作为进一步的优选。
20、优选的,所述无血清细胞培养液的制备方法包括以下步骤:取设定量基础mem培养基、199培养基、l-谷氨酰胺、碳酸氢钠、人表皮生长因子、胰岛素和海藻糖,搅拌均匀后过滤除菌,分装密封置于0-4℃的无菌环境中储存,即得所述无血清细胞培养液。
21、通过采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法,其特征在于,包括以下步骤:细胞扩增:使用无血清细胞培养液对复苏后的人二倍体细胞液进行换液,于37±1℃的温度下进行细胞扩增,收获细胞密度达到5.0×105个/mL-7.0×105个/mL的单层细胞;
2.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述基础MEM培养基和所述199培养基的重量比为5:5-8:2。
3.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述无血清细胞培养液的pH为6.8-7.0。
4.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述L-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:2-3。
5.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述人二倍体细胞为MRC-5细胞。
6.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于,所述无血清细胞培养液的制备方法包括以下步骤:
7.权利要求1-6中任一项所述的无血清细胞培养方法在狂犬病疫苗制备过程中的应用。
8.权利要求1-6中任一项所述的无血清细胞培养方
...【技术特征摘要】
1.一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法,其特征在于,包括以下步骤:细胞扩增:使用无血清细胞培养液对复苏后的人二倍体细胞液进行换液,于37±1℃的温度下进行细胞扩增,收获细胞密度达到5.0×105个/ml-7.0×105个/ml的单层细胞;
2.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述基础mem培养基和所述199培养基的重量比为5:5-8:2。
3.根据权利要求1所述的无血清细胞培养方法,其特征在于:所述无血清细胞培养液的ph为6.8-7.0。
4.根...
【专利技术属性】
技术研发人员:吴季南,储明磊,李举,李加乐,刘畅,乐丹,周卫,吴数成,
申请(专利权)人:宁波荣安生物药业有限公司,
类型:发明
国别省市:
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