【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，特别是涉及一种用于检测隐球菌的引物组、试剂盒和应用。
技术介绍
1、隐球菌是广泛存在于自然界中的一种真菌，其中包括新生隐球菌、格特隐球菌等变种。隐球菌是一种重要的条件致病菌，存在于土壤、鸽粪等环境中，主要感染免疫力低下人群，侵犯肺部、中枢神经系统，进而引起严重的肺部感染和脑膜炎，全球每年约有100万人感染隐球菌，并且造成约63万人死亡。病菌主要包括新型隐球菌和格特隐球菌，新型隐球菌多见于撒哈拉以南非洲，主要感染免疫功能低下，获得性免疫缺陷综合征(aids)和器官移植者，而格特隐球菌多见于热带和亚热带地区，但曾在温哥华岛爆发流行，常感染免疫功能正常的宿主。有研究报道:在中国，最常见的真菌病原体是假丝酵母属，其次是隐球菌属(7.7％)。近年以来，我国隐球菌属的感染逐渐增加。
2、目前，新型隐球菌的临床诊断主要依靠实验室检查，其中传统的形态学检查在临床上最为常用，其主要有墨汁染色和真菌培养。墨汁染色法操作简便、快速，一直是检测隐球菌的首选方法，但受技术人员素质、取材不理想等因素影响致敏感度不高。真菌培养法通常是将隐球菌从组织、血液、脑脊液等标本中培养分离出来，往往需要数天甚至数周，耗时且获得理想取材操作困难，因此临床上阳性率较低。多次反复的检查加重患者痛苦的同时会延误患者后期治疗,影响其预后。免疫学检验主要包括乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验、胶体金检测等。其中胶体金法是目前检测荚膜多糖抗原应用最广泛的手段，其操作简单、快速，敏感性较传统方法得到了很大程度上提高，但多种因素如类风湿因子、抗核抗体、免疫
3、近年来分子生物学技术得到了飞速发展，不仅局限于作为科研手段，还广泛应用于临床诊断。目前主要以pcr技术为主，该方法快速，灵敏度和特异度较高，但是仍存在缺点。pcr技术在扩增过程中，高温变性与低温退火反复循环，易造成气溶胶污染，且快速准确、敏感性高、特异性好的分子鉴定技术的要求较高，需要相应的设备和技术人员以及费用较高等问题。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种用于检测隐球菌的引物组，采用该引物组能够对待测样本中的隐球菌进行检测，检测结果特异性好、灵敏度高。
2、本专利技术提供了一种用于检测隐球菌的引物组，包括等温扩增引物组和grna；
3、等温扩增引物组对用于扩增隐球菌的保守序列；grna包括锚定序列和向导序列，锚定序列与cas蛋白酶结合，向导序列与扩增子序列中的靶标序列相匹配；扩增子序列由等温扩增引物组扩增保守序列得到。
4、目前隐球菌的临床诊断主要是依靠实验室检测，首先通过一般实验室检查和影像学检查进行初步筛查，再以检测隐球菌抗原抗体的免疫学检查进行诊断，而病理诊断仍为目前诊断隐球菌感染的金标准。其中临床常用的是传统的形态学检测，主要有墨汁染色和真菌培养，但这些方法耗时长，取材困难，灵敏度低，而免疫学检测虽然操作简单、快速、敏感性较传统方法得到较大程度的提高，但很多因素如类风湿因子、抗核抗体、免疫功能缺陷等均可导致免疫学检测方法的结果出现假阳性。分子生物技术可对隐球菌进行基因分型等，但存在大量假阳现象。因此，目前缺乏对隐球菌早期感染的特异性诊断方法。而以pcr技术为主的检测技术，虽然快速，灵敏度和特异度较高，但在扩增过程中，高温变性与低温退火反复循环，易造成气溶胶污染，且快速准确、敏感性高、特异性好的分子鉴定技术的要求较高，需要相应的设备和技术人员以及费用较高等问题。且目前核酸检测方法有很多种，但只有数字pcr能够做到绝对定量检测，其他的定量检测pcr大多是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而其他核酸检测方法基本是定性检测或半定量检测。
5、而本专利技术人在对上述问题的研究过程中发现，随着crispr/cas系统研究，基于crispr/cas体系开发的核酸检测方法已在传染病诊断中被广泛研究。基于crispr/cas系统的检测技术，主要包括目标物扩增与cas蛋白介导的信号检测两个部分，主要是通过人工设计向导rna(grna)，使其特异性识别靶序列，当cas蛋白与grna、靶序列形成效应复合物时，cas蛋白附属切割活性被激活，对已被标记的报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果，可实现对病原微生物特异、灵敏的现场检测。同时，等温扩增技术的反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备。lamp技术主要是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，在恒温条件下可完成核酸扩增反应，lamp方法灵敏度和特异性高，比普通pcr的敏感性要高出几个数量级。因此，本专利技术人提出将crispr/cas技术和lamp技术结合使用，针对隐球菌的保守序列设计引物组，针对等温扩增的扩增子设计grna，形成上述引物组，通过对靶标dna进行特异性扩增富集，再通过grna指引cas12b核酸酶特异性识别扩增后的靶标dna，从而对隐球菌实现检测，而这种基于等温扩增技术的crispr/cas检测方法是一种定性检测核酸的技术，与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效点且无需专用的设备，crispr/cas检测技术利用crispr酶的酶切特性，实现高灵敏度高特异性的检测。两者结核可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。并且，两个技术都可在单个较低温度下进行，降低了气溶胶的产生，降低了对设备的要求。
6、在其中一个实施例中，所述保守序列如seq id no：1所示。
7、ccaagcccccaaacctcccatacaccatcccattcccaagctcatggcagatgccaggg
8、atgagtttgaccaaaagatcaagaagcgaagcaagagcttgcccgaagccgttgccga
9、gtacaagaagaggtacggcaggaaccctcccaagggctttgatgaatggtacgcatttg
10、caaaggagaacaatgccattatcatcgacgagtatgaccagcttgatcgtgatctcaag
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12、ccttccgtcgatttggtgagggttgaaaaaggtcaaacaagaactatcgatgtgtcaaa
13、gggttttgatgactctgaagtcggtgcccgtgctaagggtttccgggtcatgcttgaaa
14、agtttcaggcgaagcttcccgatatggatttccccattaacgaaaaggcggaaggacgtat(seq idno：1)。
15、在其中一个实施例中，等温扩增引物组包括：
16、引物f3：cccaaacctccc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，包括等温扩增引物组和gRNA；
2.根据权利要求1所述的用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，所述等温扩增引物组包括：
3.根据权利要求1所述的用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，所述gRNA如SEQ IDNO：8所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于检测隐球菌的引物组在开发和/或制备具有隐球菌诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。
5.一种用于检测隐球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测隐球菌的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测隐球菌的引物组、检测反应酶和检测缓冲液；
7.根据权利要求5-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性质控品、阴性质控品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含有保守序列的质粒，所述阴性质控品包括人源细胞核酸。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
10.一种非诊断目的的隐球菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，采用权利要求5-9中任一项所述的试剂盒进行等温扩增。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，包括等温扩增引物组和grna；
2.根据权利要求1所述的用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，所述等温扩增引物组包括：
3.根据权利要求1所述的用于检测隐球菌的引物组，其特征在于，所述grna如seq idno：8所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于检测隐球菌的引物组在开发和/或制备具有隐球菌诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。
5.一种用于检测隐球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测隐球菌的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶枫，李征途，肖丽娜，李少强，高晓庆，占扬清，邱晔，王彦，方昭青，张鑫鑫，韩序，王珺，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：
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