【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物工程，尤其涉及一种工程菌株hc6-mt及其在低温生产海藻糖中的应用。
技术介绍
1、海藻糖在生物体中存在范围广泛，常作为生物体结构组成、能量代谢、贮存物质和应激代谢物存在。海藻糖是一种具有细胞保护作用的双糖，能有效地维持细胞膜完整性以及维持蛋白质的三级结构，提高细胞对非生物胁迫压力的耐受性。
2、在以往的研究中，虽然已经发现了多种可以生产海藻糖的方法，如：利用葡萄糖酸转化成功合成海藻糖，利用化学法合成海藻糖，利用酶转化法生产海藻糖等。但是，化学法制备海藻糖存在副产物多、产率低、能耗高的问题，酶转化法存在工序复杂、酶的催化效率低、底物利用率低等问题。另外，目前采用的生物制备海藻糖法，采用商品化的葡萄糖、麦芽糖等为底物，致使生产成本较高。因此，寻找更加低成本、低能耗的合成底物及合成方法成为海藻糖炼制的关键。
3、秸秆是地球上最为丰富的生物质资源，目前由于处理方式不得当而造成浪费，并且，在低温条件下微生物的酶活性受到温度限制，导致秸秆降解速率低，通常情况下微生物生物合成需要30℃以上的温度，这导致低温农业种植区的秸秆大量积累并被燃烧处理，造成大气的污染及资源的不完全利用。低温地区筛选获得的微生物可通过代谢产生冷活性酶(cold-active enzyme)从而适应低温环境。耐冷微生物在0℃至40℃的温度范围内均具有较高的生物活性，可允许工业生产中的生物催化反应在低温下进行，从而降低工业生产过程中的能量损耗。因此，提供一种新的耐冷微生物来以农业废弃物——玉米秸秆为原料进行海藻糖的生产，对于低温
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种工程菌株hc6-mt及其在低温生产海藻糖中的应用，该工程菌株hc6-mt可以在低温条件下降解玉米秸秆半纤维素生产海藻糖，并且显著提高海藻糖产量，也为海藻糖低热能、低成本、低污染的生产提供了有效方案，为农业废弃物低碳经济发展提供了新思路。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种工程菌株hc6-mt，将启动子增强过表达载体pbbr1-pd-ab导入海藻糖降解基因缺失菌株hc6-m中，构建得到所述工程菌株hc6-mt。
4、作为优选，所述启动子增强过表达载体pbbr1-pd-ab中包括从拉乌尔菌hc6中分离的低温强启动子p cspd、半纤维素关键降解基因 xynb和海藻糖合成基因 otsa。
5、作为优选，海藻糖降解基因缺失菌株hc6-m通过以下方法获得：以拉乌尔菌hc6为初始菌株，敲除拉乌尔菌hc6基因组中海藻糖降解基因 glva、 trec和 treh中的一种或多种。
6、本专利技术提供了一种拉乌尔菌hc6中低温强启动子p cspd的筛选方法，包括如下步骤：利用pcr扩增拉乌尔菌hc6的启动子序列，构建启动子荧光强度表达载体进行重组菌表达，检测重组菌od600nm和荧光强度，筛选所述检测范围内荧光强度/od600nm比值最大的启动子为低温强启动子p cspd。
7、作为优选，构建所述启动子荧光强度表达载体使用的原始载体为pet-rfp载体。
8、本专利技术还提供了所述工程菌株hc6-mt在低温生产海藻糖中的应用。
9、作为优选，将工程菌株hc6-mt与玉米秸秆半纤维素混合，发酵生产海藻糖。
10、作为优选，所述工程菌株hc6-mt以菌液的形式应用，工程菌株hc6-mt菌液的od600nm为1.7-2.3。
11、作为优选，所述发酵的温度为18-23℃，所述发酵的时间为40-52h。
12、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
13、1.本专利技术通过联合敲除海藻糖降解基因菌株hc6-m和成功构建的低温启动子增强过表达载体pbbr1-pd-ab得到工程菌株hc6-mt，该工程菌株hc6-mt可以在低温条件下通过降解由玉米秸秆提取的半纤维素来生产海藻糖，省去了外界提供热量的操作，同时强启动子导入野生菌hc6后构建出的工程菌株hc6-mt，与野生菌株相比，对半纤维素的利用率、生产海藻糖的效率有所增强，从而减少了菌株接种量，降低了生产成本；此外，还有效降低了有毒、有害副产物的产量。
14、2.本专利技术实施例中表明了所述工程菌株hc6-mt可以在20℃低温条件下通过降解玉米秸秆半纤维素生产海藻糖，使海藻糖最大产量达到1.96g/l，相对野生菌株提升54倍。后经培养条件优化，在48h海藻糖最高产量至2.28g/l。
15、3.本专利技术通过低温微生物发酵秸秆，将其转化为高附加值的产物，提高了秸秆生物利用效率的同时，又能降低环境污染压力，为农业废弃物低碳经济发展提供新思路。
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1.一种工程菌株HC6-MT，其特征在于，将启动子增强过表达载体PBBR1-PD-AB导入海藻糖降解基因缺失菌株HC6-M中，构建得到所述工程菌株HC6-MT；
2.根据权利要求1所述的工程菌株HC6-MT，其特征在于，海藻糖降解基因缺失菌株HC6-M通过以下方法获得：以拉乌尔菌HC6为初始菌株，敲除拉乌尔菌HC6基因组中海藻糖降解基因glvA、treC和TREH中的一种或多种。
3.一种拉乌尔菌HC6中低温强启动子PcspD的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：利用PCR扩增拉乌尔菌HC6的启动子序列，构建启动子荧光强度表达载体进行重组菌表达，检测重组菌OD600nm和荧光强度，筛选所述检测范围内荧光强度/OD600nm比值最大的启动子为低温强启动子PcspD。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，构建所述启动子荧光强度表达载体使用的原始载体为pET-RFP载体。
5.权利要求1或2所述工程菌株HC6-MT在低温生产海藻糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将工程菌株HC6-MT与玉米秸秆半
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述工程菌株HC6-MT以菌液的形式应用，工程菌株HC6-MT菌液的OD600nm为1.7-2.3。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为18-23℃，所述发酵的时间为40-52h。
...【技术特征摘要】
1.一种工程菌株hc6-mt，其特征在于，将启动子增强过表达载体pbbr1-pd-ab导入海藻糖降解基因缺失菌株hc6-m中，构建得到所述工程菌株hc6-mt；
2.根据权利要求1所述的工程菌株hc6-mt，其特征在于，海藻糖降解基因缺失菌株hc6-m通过以下方法获得：以拉乌尔菌hc6为初始菌株，敲除拉乌尔菌hc6基因组中海藻糖降解基因glva、trec和treh中的一种或多种。
3.一种拉乌尔菌hc6中低温强启动子pcspd的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：利用pcr扩增拉乌尔菌hc6的启动子序列，构建启动子荧光强度表达载体进行重组菌表达，检测重组菌od600nm和荧光强度，筛选所述检测范围内荧光强度/od600...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春艳，王志源，马添，臧海莲，苗蕾，成毅，徐诚蛟，李宇轩，王德智，张冰，齐家熙，王晨宇，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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