【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种基于微流控的高通量单b细胞筛选方法和应用。
技术介绍
1、抗体(antibody)是机体受抗原刺激后由浆细胞(效应b细胞)分泌的用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的蛋白质。根据识别抗原表位的数量，抗体主要分为单克隆抗体(以下简称单抗)和多克隆抗体(以下简称多抗)。单抗是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，而多抗是由多种b细胞克隆产生的混合抗体。相比之下，单抗以其高特异性、低免疫原性和批次间差异小等特点更受市场青睐，已广泛应用于科研、疾病诊断和治疗等领域。2022年全球单抗药物市场规模就超2000亿美元。因此，单抗市场规模巨大，开发单克隆抗体意义重大。
2、由于分泌抗体的b淋巴细胞在体外很难维持，因此限制了抗体的筛选。1975年英国的两位科学家kohler和milstein专利技术了杂交瘤技术，通过融合b淋巴细胞和无限增殖的骨髓瘤细胞从而实现b细胞的永生化，成功克服了b淋巴细胞在体外存活周期短的问题，为单抗筛选提供了革命性的技术。杂交瘤技术因为其成熟的筛选体系和相对较低的筛选成本，也成为目前普遍使用的单抗筛选技术。但是杂交瘤技术存在一些明显的劣势：1.细胞融合效率极低，约1/100000-1/10000的b细胞会与瘤细胞融合，这样会大大丢失抗体多样性；2.筛选周期长，约4-6个月；3.筛选工作繁琐；4.杂交瘤技术目前主要应用于鼠源性抗体开发中，需要人源化。为了解决杂交瘤技术的融合效率低，筛选工作繁琐的问题，各种展示技术(噬菌体/酵母展示技术)被开发出来。展示技
3、液滴微流控技术能将百万级单b细胞和抗体检测试剂包裹到液滴中，每个细胞形成一个独立反应腔。当包裹的b细胞分泌抗体时，液滴中荧光信号增强。对荧光在分选阈值以上的液滴施加电场，从而利用介电泳将液滴偏转到不同流道，实现高效分选。液滴中b细胞分泌的抗体量是否足以产生可检测的荧光信号是分选实验成功的关键，而目前发表的方法中均未对液滴分选前的荧光信号进行确认。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个方面提供了一种基于微流控的高通量单b细胞筛选方法，所述方法包括：将细胞相和试剂相结合并利用不相溶的油相切割得到液滴，将液滴孵育后，在荧光显微镜下确认液滴中的微球或抗原表达细胞上产生的荧光高于背景的荧光后，将液滴重新注入芯片；逐一检测芯片流道中每一个液滴的荧光强度，对荧光强度在所设阈值以上的液滴施加电场进行分选；所述细胞相为单b细胞悬液。
2、在一些实施方式中，所述细胞相和试剂相的体积比为(1-3)：(1-3)。
3、在一些实施方式中，所述细胞相和试剂相的体积比为1：1。
4、在一些实施方式中，所述试剂相为荧光二抗和抗原耦连微球的混合物或者荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物。
5、在一些实施方式中，所述荧光二抗和抗原耦连微球的混合物的制备方法包括：将微球和生物素标记的抗原共孵育后，得到抗原耦连微球，在细胞培养基和细胞悬浮液添加剂环境下同荧光标记的二抗混合，得到荧光二抗和抗原耦连微球混合物，和/或，所述荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物的制备方法包括：将表达抗原的细胞系和生物素标记的抗原共孵育后，得到抗原耦连表达抗原的细胞系，在细胞培养基和细胞悬浮液添加剂环境下同荧光标记的二抗混合，得到荧光二抗和抗原表达细胞的混合物。
6、在一些实施方式中，所述细胞相和试剂相结合方法包括：将细胞相、试剂相和油相分别置于连接注射泵的注射器内，开启注射泵，生成液滴。将单个细胞和反应试剂包裹到单个液滴中，形成一个独立反应腔，因此可以对每个细胞的分泌物进行检测。单位时间内生成的液滴数(反应腔)在106-108，因此可以高通量分析单细胞。
7、在一些实施方式中，所述细胞相的流速为150-250μl/h，试剂相的流速为150-250μl/h，油相的流速为400-450μl/h。整体流速过高会影响液滴生成过程的稳定性，也会增加对细胞的损伤；流速过低会延长液滴生成的时间，影响细胞活率，并且增加微球聚团堵塞的风险。细胞相和试剂相的相对流速会影响液滴中两者所占的比例，影响到细胞和微球的包裹率，以及液滴中的反应效率。
8、在一些实施方式中，所述微球上产生的荧光高于背景的荧光的情况发生在同时包裹微球和单b细胞的液滴中，和/或，所述抗原表达细胞上产生的荧光高于背景的荧光的情况发生在同时包裹抗原表达细胞和b细胞的液滴中。
9、在一些实施方式中，所述分选的参数为电压800-1200v，输出频率10-30khz，方波数20-80个，延迟时间0-500us，分选的阈值为背景信号峰值+3sd。通过介电泳，将荧光信号在阈值以上的液滴偏转到不同流道，液滴的分选频率为500hz，相当于1秒钟操控5块96-孔板，从而实现快速分选。
10、在一些实施方式中，所述分选的参数为电压800-1200v。
11、本专利技术的第二个方面提供了所述的筛选方法在制备抗体中的应用。
12、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
13、1.本专利技术的微流控技术产生的每一个液滴都是一个独立的反应腔，单次实验可以产生107数量级的液滴。
14、2.本专利技术中每个细胞被包裹在独立的液滴中，不仅可以通过细胞表面蛋白和胞内蛋白对细胞进行标记，还可以对根据细胞分泌物对细胞进行标记。
15、3.本专利技术的筛选方法每秒钟能够处理上千个液滴，相当于10块96孔板，相比传统杂交瘤技术，不仅筛选周期从数月缩短到一天，而且也增加了目标b细胞的数量，显著提升检测效率。
16、4.本专利技术的方法简单易于重复，原料易得，筛选成本低，具有良好的应用前景。
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1.一种基于微流控的高通量单B细胞筛选方法，其特征在于，所述方法包括：将细胞相和试剂相结合并利用不相溶的油相切割得到液滴，将液滴孵育后，在荧光显微镜下确认液滴中的微球或抗原表达细胞上产生的荧光高于背景的荧光后，将液滴重新注入芯片；逐一检测芯片流道中每一个液滴的荧光强度，对荧光强度在所设阈值以上的液滴施加电场进行分选；所述细胞相为单B细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相和试剂相的体积比为(1-3)：(1-3)。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相和试剂相的体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述试剂相为荧光二抗和抗原耦连微球的混合物或者荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述荧光二抗和抗原耦连微球的混合物的制备方法包括：将微球和生物素标记的抗原共孵育后，得到抗原耦连微球，在细胞培养基和细胞悬浮液添加剂环境下同荧光标记的二抗混合，得到荧光二抗和抗原耦连微球混合物，和/或，所述荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相和试剂相结合方法包括：将细胞相、试剂相和油相分别置于连接注射泵的注射器内，开启注射泵，生成液滴。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相的流速为150-250μL/h，试剂相的流速为150-250μL/h，油相的流速为400-450μL/h。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述微球上产生的荧光高于背景的荧光的情况发生在同时包裹微球和单B细胞的液滴中，和/或，所述抗原表达细胞上产生的荧光高于背景的荧光的情况发生在同时包裹抗原表达细胞和B细胞的液滴中。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述分选的参数为电压800-1200V，输出频率10-30KHZ，方波数20-80个，延迟时间0-500us，分选的阈值为背景信号峰值+3SD。
10.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述电场的电压为800-1200V。
11.权利要求1-10任一项所述的筛选方法在制备抗体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于微流控的高通量单b细胞筛选方法，其特征在于，所述方法包括：将细胞相和试剂相结合并利用不相溶的油相切割得到液滴，将液滴孵育后，在荧光显微镜下确认液滴中的微球或抗原表达细胞上产生的荧光高于背景的荧光后，将液滴重新注入芯片；逐一检测芯片流道中每一个液滴的荧光强度，对荧光强度在所设阈值以上的液滴施加电场进行分选；所述细胞相为单b细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相和试剂相的体积比为(1-3)：(1-3)。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞相和试剂相的体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述试剂相为荧光二抗和抗原耦连微球的混合物或者荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述荧光二抗和抗原耦连微球的混合物的制备方法包括：将微球和生物素标记的抗原共孵育后，得到抗原耦连微球，在细胞培养基和细胞悬浮液添加剂环境下同荧光标记的二抗混合，得到荧光二抗和抗原耦连微球混合物，和/或，所述荧光二抗和表达抗原的细胞系的混合物的制备方法包括：将表达抗原的细胞系和生物素标记的抗原共孵育后，得到抗原耦连表...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑文山，李元元，任次成，郑涵睿，黄永银，裴颢，
申请(专利权)人：墨卓生物科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：
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