【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于以高产率纯化目标蛋白的方法。更具体地，本专利技术涉及用于以高产率纯化膜蛋白的方法。
技术介绍
1、膜蛋白是在细胞内外传递信号的重要蛋白，与多种疾病相关。具体来说，膜蛋白在细胞内外产生离子浓度差异，或用于atp合成，参与神经细胞或肌肉细胞中电信号的产生和传递。特别地，膜蛋白是活性药物成分的主要靶标，也是最近正在开发的治疗性单克隆抗体的靶标。
2、迄今为止，大量的膜蛋白仍然未知，需要研究以阐明膜蛋白的特性和功能。然而，由于膜蛋白比细胞质中存在的蛋白具有更高的疏水性且存在于脂质双层中，因此提取和纯化并不容易，相关研究进展缓慢。在膜蛋白相关的研究中存在一个局限性，即细胞膜中存在的膜蛋白本身的量非常少，而膜蛋白所在的细胞膜具有大量的脂肪和糖，使得膜蛋白的纯化变得困难。
3、目前，molloy等人开发了使用洗涤剂提取膜蛋白的方法作为分离和纯化膜蛋白的方法，其特征在于使用尿素、硫脲、chaps等的三步提取方法。根据molloy等人的方法，粉碎细胞或组织，通过离心除去上清液，收集包括膜蛋白在内的沉淀物，使用洗涤剂提取与脂质层或细胞壁结合的膜蛋白。该方法主要使用的洗涤剂包括triton-x100、nonidet p-40(np-40)、4-辛基苯甲酰氨基磺基甜菜碱、asb14等。此外，另一种分离和纯化膜的方法是对样品进行离心。在此方法中，细胞被粉碎并离心以分离膜级分。这种方法的缺点是需要额外的验证过程，且耗时较长。
4、此外，已知标记和层析法，通过超滤选择性浓缩具有不同ph特性的蛋白的方法
5、[现有技术文献]
6、[非专利文献]
7、(非专利文献1)m.walid qoronfleh等人，j biomed biotechnol.，2003年10月29日；2003(4)：249-255。
技术实现思路
1、技术问题
2、因此，本专利技术人研究开发了一种高效分离和纯化膜蛋白的技术，由此建立了最佳的破碎和洗脱条件，发现当使用上述条件分离和纯化膜蛋白时可以高产率地获得膜蛋白，从而完成本专利技术。
3、解决问题的方案
4、为了实现上述目的，本专利技术的一个方面提供了一种纯化目标蛋白的方法，该方法包括以下步骤：i)使用超声仪(sonicator)、均质器(homogenizer)或微流化仪(microfludizer)破碎细胞；ii)获得细胞膜级分；iii)使用超声仪、均质器或微流化仪破碎细胞膜级分；以及iv)分离目标蛋白。
5、本专利技术的有益效果
6、根据本专利技术的纯化方法在分离纯化膜蛋白的过程中已经优化了破碎和洗脱条件，当采用本专利技术的纯化方法纯化膜蛋白时，膜蛋白的纯化率可以是使用常规均质器或超声处理纯化膜蛋白的情况的至少100倍。此外，当通过使用本专利技术的纯化方法纯化膜蛋白时，细胞核、过氧化物酶体和溶酶体被去除，因此可以减少dna污染和由蛋白酶造成的蛋白损伤。因此，本专利技术可以有效地用于纯化膜蛋白。
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1.一种纯化目标蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤i)中，所述微流化仪在3,500psi至6,000psi的压力下重复进行一次至七次。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤ii)中，所述细胞膜级分是通过差速离心获得的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述差速离心通过初次离心和二次离心进行两次。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述初次离心以8,000×g至11,000×g的速度进行。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述二次离心以140,000×g至160,000×g的速度进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iii)中，所述微流化仪在15,000psi至25,000psi的压力下重复进行三次至七次。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iii)中，将含有表面活性剂的提取缓冲液添加到所述细胞膜级分中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述表面活性剂是选自SDS、TritonX-100、NonidetP-40、辛基-b
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iv)中，所述分离采用超速离心。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述超速离心以80,000×g至120,000×g的速度进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白是膜蛋白。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述动物细胞是昆虫细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述昆虫细胞是选自以下的任意一种：粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的BT1-Tn-5B1-4细胞、舞毒蛾(Lymantria dispar)的LD652Y细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf21细胞、果蝇(Drosophila)的Kc1细胞、果蝇的SL2细胞和蚊子细胞系。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化目标蛋白的方法包括：在步骤i)中进行均质化10次至20次；在步骤ii)中，以2,500×g至3,500×g的速度进行初次离心10分钟至30分钟，然后以4,000×g至6,000×g的速度进行二次离心20分钟至40分钟；在步骤iii)中，进行均质化三次至七次；以及在步骤iv)中，以4000×g至6000×g的速度进行离心20分钟至40分钟。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化目标蛋白的方法包括：在步骤i)中，进行超声处理5分钟至30分钟；在步骤ii)中，以100×g至1,000×g的速度进行初级离心1分钟至3分钟，然后以12,000×g至14,000×g的速度进行二次离心10分钟至20分钟；在步骤iii)中，进行超声处理10分钟至30分钟；以及在步骤iv)中，以10,000×g至15,000×g的速度进行离心20分钟至40分钟。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤i)中，另外进行表面活性剂处理。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种纯化目标蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤i)中，所述微流化仪在3,500psi至6,000psi的压力下重复进行一次至七次。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤ii)中，所述细胞膜级分是通过差速离心获得的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述差速离心通过初次离心和二次离心进行两次。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述初次离心以8,000×g至11,000×g的速度进行。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述二次离心以140,000×g至160,000×g的速度进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iii)中，所述微流化仪在15,000psi至25,000psi的压力下重复进行三次至七次。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iii)中，将含有表面活性剂的提取缓冲液添加到所述细胞膜级分中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述表面活性剂是选自sds、tritonx-100、nonidetp-40、辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-b-d-麦芽糖苷和zwittergent 3-16中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iv)中，所述分离采用超速离心。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述超速离心以80,000×g至120,000×g的速度进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白是膜蛋白。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是动...
【专利技术属性】
技术研发人员：金鹤，权泰佑，徐基元，
申请(专利权)人：SK生物科学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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