一种分离纯化淡水鱼致敏蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种属于蛋白质纯化技术领域的分离纯化淡水鱼致敏蛋白的方法。该方法将富含致敏蛋白的淡水鱼组织经过粗提，在离子交换层析柱中进行梯度洗脱，并用高效液相色谱进一步的分离纯化，提高纯度，包括将原料经以下层析步骤：（ａ）双层功能的可耐受高盐型的阳离子交换；（ｂ）反向高效液相色谱分离。该方法与传统方法相比具有分辨率高、重复性好、操作简便，纯化出的致敏蛋白纯度高的特点。此方法具有以下优点：（１）离子交换柱有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大；（２）具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活；（３）多孔性，表面积大、交换容量大的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质纯化
，具体涉及一系列的层析步骤分离纯化淡水鱼致 敏蛋白的方法。
技术介绍
随着社会发展，人们饮食结构的变化，食品过敏发病率日益增高，在全世界范围内 呈逐年增加的趋势。在美国，近5%的3岁以下的儿童和1.5%的成人受到食物过敏的困扰， 这意味着约400万人患有食物过敏症。英国成人的患病率在1. 4% 1. 9%，儿童为5%，大 约有100万人反应严重。中国疾控中心营养与食品安全所的调查表明在15至24岁年龄 段健康人群中，约有6%的人曾患有食物过敏。过敏症状在临床上表现为荨麻疹、哮喘、腹痛 和腹泻等多种症状，严重的可导致休克。它已经越来越影响到人类的生活质量，甚至给人们 的生命健康造成了巨大威胁。目前，过敏性疾病已经成为各国政府高度关注的一个全球性 的问题，食品过敏已成为世界卫生组织(WHO)和世界粮农组织(FAO)关注的重大卫生学问 题。鱼类是世界上公认的8类高致敏食物之一。在亚洲，由于饮食习惯的问题，鱼类致敏的 现象显得更为突出，对鱼类和甲壳过敏的人占总人口的2%，5. 9%的家庭中至少有一个人 对水产品过敏，对鱼类的特异性过敏在婴幼儿中尤为常见。因此研究鱼类致敏蛋白就显得十分重要，其首要解决的问题就是鱼类致敏蛋白的 分离纯化。蛋白质的功能性质不仅与其来源、加工方法等有关，而且与蛋白质的物理化学性 质、结构特征等密切相关，包括蛋白质的大小、形状、氨基酸组成及序列、带电情况及其分 布、疏水/亲水比例、二级结构及其含量分布、三级及四级结构、分子内或分子间交联以及 蛋白质在溶液环境中的分子伸展情况(即分子柔性)等..·，而蛋白质的分离纯化研究对其 结构特性研究极为重要。蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自 然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白 质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是 有相当难度的。目前蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用， 但基本原理均是以蛋白质的性质为依据的。破碎组织细胞，提取蛋白质混合物，利用盐析 法、有机溶剂沉淀法等对蛋白质进行粗提；电泳和色谱技术则可对粗提蛋白质进行进一步 的分离纯化，而且可对纯化蛋白质进行制备。实际工作中应按不同的要求和条件选用不同 的方法。目前，国内外有关鱼类致敏蛋白分离纯化报道较少，现有的分离方法主要采用树 脂填料对致敏蛋白进行初步分离纯化，纯度不高，并且分辨率低、重复性差。本专利技术采用柱 层析与高效液相色谱分级层析，可以分离出纯度极高的致敏蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目是提供分离纯化淡水鱼致敏蛋白的方法，通过该方法获得的鱼类致敏 蛋白纯度高、回收率高且蛋白活性佳。，包括以下操作步骤(1)破碎淡水鱼组织细胞，利用盐析法提取蛋白质混合物；(2)透析去除蛋白质混合物中的盐；(3)采用双层功能的可耐受高盐型的阳离子交换柱对蛋白质混合物进行初步分 离，具体方法如下将步骤(2)除盐的蛋白质混合物加入到平衡后的阳离子交换柱中，用PH 7. 5的含0. 5-1. 5mol/L NaCl的IOmmol Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3mL/ min，收集保留时间为21min的洗脱峰；(4)对收集的洗脱液进行反向高效液相色谱分离，所用色谱柱为AscentisExpress peptide ES-C18HPLC，所用流动相为乙腈、三氟乙酸、双蒸水，参数条件为B泵双蒸水 +70%三氟乙酸，D泵30%乙腈，流动相体积比B D = 25 75，流速为0. 8mL/min，操作 压力为30-230pa，检测波长为280nm，最终收集保留时间为33. 282min的洗脱峰，收集的洗 脱液即为淡水鱼致敏蛋白。其中，三氟乙酸为色谱级纯三氟乙酸，双蒸水为超声脱气的双蒸 水。步骤(1)中所述淡水鱼组织为新鲜淡水鱼肌肉组织。步骤(1)中所述盐析法是指用40% (w/v)的硫酸铵水溶液沉淀杂质，取上清；再 用90% (w/v)的硫酸铵水溶液沉淀蛋白混合物。步骤(2)中所述透析使用的透析袋为截流Mr8000-14000 D16mm透析袋。步骤(3) 中所述阳离子交换柱中的填充物为琼脂糖凝胶CL-6B(S印har0Se-CL-6B)。本专利技术的有益效果首先采用阳离子柱交换吸附的方法对鱼类蛋白进行了初步分 离，此方法具有(1)离子交换柱有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸 附容量大；(2)具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起 蛋白质变性或酶的失活；(3)多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高的优点。其次采用 反向高效液相色谱对其进行了进一步的分离纯化，此方法可使用挥发性体系如水溶三氟乙 酸、乙腈，纯化产物不必进行脱盐，因此，可大大简化操作步骤。该方法与传统方法相比具有 分辨率和回收率高、重复性好、操作简便，纯化出的致敏蛋白纯度高、活性极佳的特点。附图说明图1为经阳离子交换柱分离得到的致敏蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图；泳道1为淡 水鱼全蛋白；泳道2和3为经阳离子交换柱分离得到的致敏蛋白图2是经反向高效液相色谱法分离后得到的致敏蛋白的色谱图；图3是经反向高效液相色谱法鉴定最终获得的致敏蛋白纯度的色谱图。图4是本专利技术方法制得的致敏蛋白的活性检测结果图。其中，1为本专利技术方法制得的致敏蛋白与正常人血清的ELISA结果；2为采用本发 明方法制得的致敏蛋白与鱼过敏患者血清的ELISA结果，3为牛血清白蛋白与鱼过敏患者 血清的ELISA结果具体实施例方式本专利技术的方法通过以下实施例来进行详细的说明。实施例(1)取新鲜淡水鱼肌肉组织5g，加入IOmL 40Mm的Tris-HCl溶液，用组织捣碎机 充分破碎混勻，在4°C、12000r/min条件下离心20分钟取上清；用40% (w/v)的硫酸铵水 溶液沉淀杂质，取上清；再用90% (w/v)的硫酸铵水溶液沉淀蛋白混合物；(2)用重蒸水透析上述蛋白混合物48小时，其中，透析袋为截流Mr8000-14000 D16mm透析袋(购自北京拜尔迪生物科技有限责任公司公司)；(3)采用阳离子柱交换吸附的方法对蛋白质混合物进行初步分离，具体如下A、琼脂糖凝胶CL-6B离子交换色谱柱装柱；分离范围10000-4000000 ；颗粒大小 (微米)45-65B、采用Ι 7. 0,0. 01mol/L磷酸盐缓冲液对S印harose-CL_6B离子交换柱进行平衡；C、取2ml透析后的蛋白样品上至S印haroSe-CL-6B离子交换色谱柱，用PH7. 5含 0. 5-1. 5mol/L NaCl的IOmmol Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3ml/min，收集 保留时间为21min的洗脱峰；对收集液进行SDS-PAGE蛋白电泳，结果如图1所示，得到电泳纯级别的致敏 蛋白。其中，泳道1为未经分离纯化的淡水鱼全蛋白。泳道2、3为经过琼脂糖凝胶 Sepharose-cl-6B离子交换色谱柱分离后得到的致敏蛋白。 (4)反向高效液相色谱进一步分离纯化致敏蛋白根据以下参数对步骤(3)的收集液进行分离纯化所用色谱柱为AscentisExpress peptid本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化淡水鱼致敏蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：　　（１）破碎淡水鱼组织细胞，利用盐析法提取蛋白质混合物；　　（２）透析去除蛋白质混合物中的盐；　　（３）采用双层功能的可耐受高盐型的阳离子交换柱对蛋白质混合物进行初步分离，具体方法如下：将步骤（２）除盐的蛋白质混合物加入到平衡后的阳离子交换柱中，用ＰＨ　７．５的含０．５－１．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１０ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为３ｍＬ／ｍｉｎ，收集保留时间为２１ｍｉｎ的洗脱峰；　　（４）对收集的洗脱液进行反向高效液相色谱分离，所用色谱柱为ＡｓｃｅｎｔｉｓＥｘｐｒｅｓｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ＥＳ－Ｃ１８ＨＰＬＣ，所用流动相为乙腈、三氟乙酸、双蒸水，参数条件为：Ｂ泵双蒸水＋７０％三氟乙酸，Ｄ泵３０％乙腈，流动相体积比Ｂ∶Ｄ＝２５∶７５，流速为０．８ｍＬ／ｍｉｎ，操作压力为３０－２３０ｐａ，检测波长为２８０ｎｍ，最终收集保留时间为３３．２８２ｍｉｎ的洗脱峰，收集的洗脱液即为淡水鱼致敏蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛文通，刘蓉，刘楚怡，张惠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]