一种东北虎肠道益生菌群的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种东北虎肠道益生菌群的制备方法。首先制备嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌５株益生菌发酵液，在５０００转／分钟后弃掉上清液，分别取每种益生菌菌泥１０克，添加食用菌姬松茸粉末４克，与含有２．５％海藻酸钠与０．５％亚麻籽胶的混合胶体４０ｇ混合，添加１．５倍体积食用油、１．５％ＣａＣｌ２溶液钙化３ｈ，生理盐水洗涤凝胶球三次，将胶球置于０．６％，ｐＨ＝５．５的壳聚糖溶液中成膜反应１５ｍｉｎ后取出，用灭菌生理盐水冲洗后置于５５ｍＭ的柠檬酸溶液中液化３０ｍｉｎ，生理盐水冲洗后得益生菌泥，最后冷冻干燥获得肠道益生菌粉，经过不同益生菌粉的复配获得肠道益生菌群。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属生物工程领域。
技术介绍
近几十年来，由于人类活动对环境的造成栖息地破碎化和食物短缺，以及人类的非法盗猎、扑杀和贸易造成野生东北虎生种群数量急剧下降，东北虎已被列入中国I级保 护动物并被列入濒危野生动植物种。目前在我国各种类型的动物园有120多家其中约有40 多家有东北虎。尤其是以黑龙江东北虎林园、广西桂林雄森熊虎山庄等代表的大型猫科动 物繁殖基地为东北虎动物种群的扩大作出了巨大贡献，已有的圈养东北虎种群将成为野生 种群扩大发展的重要后备力量。但随着东北虎种群数量的增加和饲养密度的加大，一些危害严重的传染病发生的 机会也随之增加。尤其是东北虎幼仔，抵抗力较差，常发生大肠杆菌、魏氏梭菌、细小病毒感 染等消化道疾病，极大地降低了幼虎的成活率。我们研究认为，正常条件下，幼龄东北虎肠 道内一般都存在正常菌群。菌群之间靠相互制约来维持相对平衡，正常菌群中的细菌一般 对虎不致病，相反，有些细菌对虎体具有益生的生理作用。例如双歧杆菌菌体代谢产生多种 维生素，可促进虎体的生长发育。然而，由于幼虎的抵抗力较差，各种应急反应和大量使用 抗生素治疗疾病时，都极易导致肠道内的正常菌群失调，导致一些消化道传染病的发生。应 用了微生态制剂后，逐步恢复了肠道内正常菌群，改善了胃肠功能，提高了食物消化率，抑 制了肠道腐败菌生长、增强了机体免疫力。本专利技术采用5株肠道益生菌为出发菌株，经过体外包埋后制成微生态菌剂，添加 于饲料中东北虎幼崽，1年多来的反馈情况表明，饲喂后幼虎的消化道疾病发生明显减少， 幼虎的成活率明显提高。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术中所涉及的百分比除另有注明之外为质量 比，本专利技术的产品采用这样的方法来制备的1.益生菌的选择及培养基的制备A 菌-嗜酸乳杆菌 CICC6OM (Lactobacillus acidophilus)，培养基为蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2 克，硫酸镁0. 2克，硫酸锰0. 2克，吐温801毫升，水1000毫升，ρΗ6· 2-6. 6。B 菌-植物乳杆菌 CICC6002 (Lactobacillus plantarum)5° Β 麦芽汁中加入酵母膏0.5，无菌碳酸钙0.6。C 菌-乳酸乳球菌 CICC23610 (Lactobacillus lactis)蛋白胨 10 克，牛肉膏 10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克，硫酸镁0. 2 克，硫酸锰0. 2克，吐温801毫升，水1000毫升，琼脂1. 5 2. 0%,pH6. 2-6. 6。D 菌-鼠李糖乳杆菌 CICC6001 (Lactobacillus rhamnosus)5° B6 麦芽汁中加入酵母膏0. 5，无菌碳酸钙0. 6。E 菌-两歧双歧杆菌 CICC6168 (Bifidobacterium bifidum)酪蛋白胨10g，肉汤提取物5g，酵母提取物5g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖10g，吐温 801ml, K2HP04 2g/L, MgS04X7H20 0. 2g/L, MnS04x H20 0. 05g/L, NaCl 5g，盐溶液 4ml，刃天 青(25mg/100ml) 4ml，蒸馏水950ml，培养基煮至沸腾，添加半胱氨酸，调pH至6. 8后，在C02 下冷却。盐溶液CaCl2X2H20 0. 25g/L, KH2P04 lg/L, K2HP04 lg/L, MgS04X7H20 0. 5g/L, NaHC03 lOg/L, NaCl 2g/L2.益生菌群的制备过程2.1冻干菌粉末的活化分别量取0. 9%的生理盐水10ml于5只试管内，经121 °C灭菌20分钟冷却至30°C， 将5株乳酸菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0. 9%的生理盐水中，震荡使其 溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。2. 2益生菌扩大培养2.2. 1母发酵剂的制备分别量取5株益生菌培养基各200ml于5只500ml三角瓶内，121°C灭菌20分钟 冷却至30°C，按培养基体积的10%接种2. 1步骤中已经活化的菌种，在30°C厌氧箱内静止 培养24小时，作为母发酵剂。2. 2. 2益生菌扩培首先配置10%的脱脂奶乳浊液，121°C灭菌20分钟冷却至30°C，分别按2%体积 比例接种母发酵剂，30°C厌氧培养30-36小时，检测5株乳酸菌发酵液活菌数，各发酵液活 菌数彡109个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< 109个/ml，继续培养，直至达到109个/ ml，然后在无菌状态下5000转/分钟离心20分钟，弃掉上清液，留菌泥包埋待用。2. 3微生态菌剂包埋分别取每种待包埋益生菌菌泥10克，然后称取细度为200目的食用菌姬松茸粉末 4克，与含有2. 5%海藻酸钠与0. 5%亚麻籽胶的混合胶体40g混合，200r/min进行第一次 搅拌20min，将混合物缓慢倾倒入盛有1. 5倍体积食用油的三角瓶中，400r/min进行第二次 搅拌20min，加入1. 5% CaCl2溶液钙化3h，用灭菌生理盐水洗涤凝胶球三次，将胶球置于 0.6%,pH=5.5的壳聚糖溶液中进行成膜反应，15min后取出，用灭菌生理盐水冲洗后置于 55mM的柠檬酸溶液中液化30min，灭菌生理盐水冲洗后得湿的菌剂微胶囊，150r/min离心 lOmin收集微胶囊，预冷，最后冷冻干燥获得包埋后的微生态菌剂。2. 4微生态菌剂复配按各微生态菌剂重量，取A菌2-4份，B菌1_3份，C菌3_5份，D菌2_3份，E菌 5-7份充分混勻后真空包装。3.应用效果下面通过具体实验来证明本专利技术专利的应用效果将体重在8-10公斤的东北虎幼崽每10只分为1组，试验时间20天。表1益生菌群对东北虎幼崽的作用效果4 三个试验组的日增重差别不大，患病比例明显低于对照组，说明本专利技术的微生态 菌剂对东北虎幼崽来说每天只需要饲喂10克，即可明显提高机体免疫力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作更详细的描述实施例一本专利技术采用的5株益生菌均采购于中国工业微生物菌种保藏中心，分别为 嗜酸乳杆菌CICC 6074，植物乳杆菌CICC 6002，乳酸乳球菌CICC23610，鼠李糖乳杆菌 CICC6001，两歧双歧杆菌CICC6168，本专利技术中将上述菌株简称为A菌、B菌、C菌、D菌、E菌。1.益生菌的选择及培养基的制备A 菌-嗜酸乳杆菌 CICC6OM (Lactobacillus acidophilus)，培养基为蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2 克，硫酸镁0. 2克，硫酸锰0. 2克，吐温801毫升，水1000毫升，ρΗ6· 2-6. 6。B 菌-植物乳杆菌 CICC6002 (Lactobacillus plantarum)5° Β 麦芽汁中加入酵母膏0.5，无菌碳酸钙0.6。C 菌-乳酸乳球菌 CICC23610 (Lactobacillus lactis)蛋白胨 10 克，牛肉膏 10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种东北虎肠道益生菌群的制备方法，其特征是：制备嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌５株益生菌发酵液，然后在５０００转／分钟后弃掉上清液，分别取每种益生菌菌泥１０克，添加细度为２００目的食用菌姬松茸粉末４克，与含有２．５％海藻酸钠与０．５％亚麻籽胶的混合胶体４０ｇ混合，２００ｒ／ｍｉｎ进行第一次搅拌２０ｍｉｎ，将混合物倒入盛有１．５倍体积食用油的三角瓶中，４００ｒ／ｍｉｎ进行第二次搅拌２０ｍｉｎ，加入１．５％ＣａＣｌ↓［２］溶液钙化３ｈ，用灭菌生理盐水洗涤凝胶球三次，将胶球置于０．６％，ｐＨ＝５．５的壳聚糖溶液中成膜反应１５ｍｉｎ后取出，用灭菌生理盐水冲洗后置于５５ｍＭ的柠檬酸溶液中液化３０ｍｉｎ，灭菌生理盐水冲洗后得湿的益生菌，１５０ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集益生菌，预冷，最后冷冻干燥获得肠道益生菌，经过不同益生菌粉的复配获得肠道益生菌群。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢明伟，韩建春，曾祥伟，柴洪亮，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]