本发明专利技术涉及农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤：制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；共培养后的外植体接入筛选培养基Ｃ１３ＰＣ进行培养，从而获得抗性愈伤组织，该筛选培养基Ｃ１３ＰＣ含有１－３ｍｇ／Ｌ草胺磷或１－１０ｍｇ／Ｌ潮霉素；将得到的抗性愈伤组织转入分化培养基，分化出不定芽；经生根培养，获得转基因植株。利用本发明专利技术转基因方法成功导入功能基因，对野生麻风树进行遗传改良。转化效率可达１０％左右甚至１０％以上，转基因性遗传稳定，成本低廉，且麻风树离体再生系统稳定性好，操作简便，再生效率高，从愈伤组织的诱导到再生植株的获得只需要８０－９０天。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及麻风树的组织培养
及基因工程领域，尤其是指农杆菌介导对 麻风树进行基因转化的方法，从而获得转基因植株。
技术介绍
麻风树(Jatopha curcas)，又名小桐子、柴油树，为大戟科麻风树属，多年生落叶 灌木或小乔木，分布于热带和亚热带地区。它为喜光阳性植物，根系粗壮发达，具有较强的 耐干旱瘠薄能力，可以种植在其他植物不易生长的土地上，是干旱地区理想的造林树种。麻 风树种仁含油量高达50% 60%，可以提炼出不含硫、无污染、符合欧四排放标准的生物 柴油，是世界公认的生物能源树；也可作药用，常用于清热解毒，消肿散瘀等；近年来的研 究发现，该植物还具有显著的抗癌活性。因此麻风树具有广泛的开发利用价值。目前，我国在麻风树育种方面的工作才刚刚开始。由于麻风树多为野生状态，又为 木本植物，采用常规育种来改变其遗传性状十分困难。因此，采用现代生物技术手段，如转 基因技术进行辅助育种成为首选。植物转基因技术的前提是高效的离体再生系统。近些年 来，麻疯树组织培养技术也获得成功，采用的外植体有种胚、子叶、上胚轴、下胚轴、叶柄、叶 片，胚乳，花药，甚至老龄树(20年以上)长出的幼嫩茎段，然而再生频率有待进一步提高。植物转基因技术因能主动导入外源基因，定向改造植物性状日益受到人们的重 视。植物遗传转化技术可分为两大类一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体 法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表； 另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法。以根癌农杆 菌介导的植物遗传转化是目前最有效的途径之一。然而，由于麻风树的遗传转化研究起步 较晚，因此，对麻风树进行遗传改良，通过导入外源基因，对其进行定向性状改造，具有十分 重要的经济价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方 法，解决现有育种技术无法遗传改良的问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案农杆菌介导对麻风树进行基因转 化的方法，包括以下步骤(1)制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；(2)共培养后的外植体接入筛选培养基C13PC进行培养，从而获得抗性愈伤组织， 所述筛选培养基C13PC是含有l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素；(3)分化出不定芽；以及(4)生根培养，从而获得转基因植株。所述第(1)步骤中，共培养优选采用C13A培养基含有50-200 u M乙酰丁酰酮。所述第(1)步骤中，共培养采用优选采用C13A固体培养基，其含有1. 0-3. Omg/L6_苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200 y M乙酰丁酰酮的MS培养基；麻风树 外植体的制备经由以下工艺挑选麻风树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，于MS培养 基培养，获得子叶，切制成外植体；农杆菌菌液是优选采用C13A液体培养基重悬浮离心收 集的农杆菌体制得。所述第(1)步骤中，获得麻风树外植体工艺中，接种于MS培养基萌发，是将接好的 材料先暗培养2-4天，然后光照培养10-12天，种子萌发的培养条件是，温度23-26°C，光照 12-16小时/天，光照强度1800-20001x。所述第(1)步骤中，农杆菌菌液的准备、浸染及共培养，进一步包括以下工艺步 骤(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28°C，200rpm震荡培 养20-24小时，然后按照1 100转接，震荡培养至对数生长期，0D600 = 0.8-1.0，将菌液 转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆 菌，调至0D600 = 0. 3-0.6，28°C震荡培养1-2个小时，备用；(b)将切好的叶片放入容器中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速震荡5-15分钟； 以及(c)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入 C13A固体培养基，置于23-26°C黑暗共培养2_4天。所述第(2)步骤的筛选培养基C13PC是优选采用含有1. 0-3. Omg/L 6_苄基嘌呤， 0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基。所述第(2)步骤进一步包括以下工艺步骤(a)取出共培养后的外植体，放入容器中，加入无菌水洗后，用含250_500mg/L头 孢霉素的无菌水洗；(b)洗过的愈伤组织放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC，所述筛 选培养基C13PC较佳采用MS培养基含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁 酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠，2-3%蔗糖，0. 7%琼脂， 以及pH5. 8-6.0)；以及(c)置于23_26°C暗培养14_21天，获得抗性愈伤组织。所述第(3)步骤，是将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC进行培养，该 分化培养基SR13PC优选含l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素。所述第(3)步骤的分化培养基SR13PC较佳采用MS培养基含0. 25-2. 0mg/L6-苄 基嘌呤，0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L赤霉素，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉 素，250-500mg/L头孢霉素，20_30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈伤组 织在23-26°C，光照培养10-60天即可得到不定芽，培养条件为，光照12-16小时/天，光照 强度 1800-20001x。所述第(4)步骤进一步包括以下工艺步骤将分化出的不定芽优选在0. 1-1. Omg/ L的3-吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分钟后，接种到1/2MS培养基进行生根培养，10-60天即 可生根，生根培养条件为，23-26°C，光照12-16小时/天，光照强度1800-20001X，从而获得转基因植株。上述，农杆菌携带有目的基因。本专利技术的有益效果如下本专利技术利用农杆菌浸染和共培养，在有效的抗性愈伤组 织筛选和分化体系基础上，对麻风树进行转基因，使采用转基因方法导入功能基因对麻风 树进行遗传改良成为可能，转化效率可达10%左右甚至10%以上。因农杆菌介导的转化方 法具转化的基因多为单拷贝，且有明确的边界序列，遗传稳定，多数符合孟德尔遗传规律， 成本低廉，且麻风树离体再生系统稳定性好，操作简便，再生效率高，从愈伤组织的诱导到 再生植株的获得只需要80-90天。本专利技术选择了合适的筛选剂浓度，建立了有效的抗性愈伤组织筛选体系，既避免 了非转化愈伤的大量逃逸，又获得了抗性愈伤组织。与其他部位相比，利用麻风树的成熟种子萌发后的子叶作为外植体不仅愈伤得出 率和愈伤分化率较高，且不受季节的限制，为大批量进行农杆菌转化奠定了良好的基础。本专利技术在抗性愈伤组织分化阶段采用了合适的筛选剂浓度，既对非转化植株进行 了抑制，避免了后期大量的分子检测工作，又保证了抗性植株的正常生长和分化。本专利技术在抗性植株生根阶段选用吲哚本文档来自技高网...
【技术保护点】
农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤： （１）制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养； （２）共培养后的外植体接入筛选培养基进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基含有１－３ｍｇ／Ｌ草胺磷或１－１０ｍｇ／Ｌ潮霉素； （３）分化出不定芽；以及 （４）生根培养，从而获得转基因植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李耿光，孙怀娟，王梅珍，李凝，
申请(专利权)人：普罗米绿色能源深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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