【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、通过遗传修饰产生肿瘤特异性t淋巴细胞以表达嵌合抗原受体(car)，这作为能够产生强大的抗肿瘤作用的合成生物学的一种形式越来越受到关注(jena等人，2010，blood[血液].116：1035-1044；bonini等人，2011，biol blood marrow transplant[血液和骨髓移植生物学]17(1增刊)：s15-20；restifo等人，2012，nat rev immunol[自然免疫学评论]12：269-281；kohn等人，2011，mol ther[分子治疗]19：432-438；savoldo等人，2011，j clininvest[临床研究杂志]121：1822-1825；ertl等人，2011，cancer res[癌症研究]71：3175-3181)。由于特异性是由抗体片段赋予的，因此car-t细胞不受mhc限制，因此比基于需要mhc匹配的t细胞受体的方法更实用。
2、因此，car-t细胞疗法代表了个性化癌症治疗的重大进步。在该策略中，患者自身的t细胞经过遗传工程改造以表达结合肿瘤抗原的合成受体。然后，car-t细胞被扩增用于临床，并回输到患者体内，以攻击和消灭化疗耐药的癌症。在b细胞恶性肿瘤的car-t细胞疗法中观察到显著的临床反应和高完全缓解率。这导致fda最近批准了两项针对cd19蛋白的car-t细胞用于治疗急性淋巴母细胞性白血病和弥漫性大b细胞淋巴瘤。因此，car-t细胞可以说是合成生物学和个性化细胞癌症疗法率先商业化的成功示例之一。
3、尽
技术实现思路
1、本披露涉及一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd3+t细胞；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。本披露还涉及一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)获得包含cd3+t细胞群的样品；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。本披露还涉及一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在含有人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。在一些方面，培养基进一步包含人白细胞介素2(il-2)。
2、在一些方面，部分(d)包括用包含编码car的核酸的载体转导cd3+t细胞以产生car-t细胞。在一些方面，部分(d)包括用包含编码tcr的核酸的载体转导cd3+t细胞以产生tcr细胞。在一些方面，在步骤(b)中在培养基中培养约1x106至约1x109个cd3+t细胞。在一些方面，样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。在一些方面，将步骤(c)中的cd3+t细胞培养约一天或约两天。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用cd2、cd3、cd28或其任何组合的激动剂激活。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用磁性微珠激活。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用抗cd3抗体或其cd3结合片段和抗cd28抗体或其cd28结合片段激活。在一些方面，抗cd3抗体或其cd3结合片段以及抗cd28抗体或其cd28结合片段与磁性微珠偶联。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。在一些方面，car-t t细胞在步骤(e)中培养约四天。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约六天。在一些方面，人il-21的浓度为约0.01u/ml至约0.3u/ml，并且人il-2的浓度为约5iu/ml至约100iu/ml。在一些方面，人il-21的浓度为约o.19u/ml。在一些方面，人il-2的浓度为约40iu/ml。在一些方面，在步骤(b)期间搅动cd3+t细胞。本披露的方法涉及一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在包含浓度为40iu/ml的人白细胞介素2和浓度为0.19u/ml的人白细胞介素21的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)用包含抗cd3抗体或其cd3结合片段和抗cd28抗体或其cd28结合片段的磁珠激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的慢病毒载体病毒转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞；(e)将这些car-t细胞在培养基中培养约四天；以及(f)收获这些car-t细胞。
3、在一些方面，通过阳性选择分离cd4+和cd8+t细胞。在一些方面，载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、转座子、dna载体、mrna、脂质纳米颗粒(lnp)或crispr-cas系统。在一些方面，载体是慢病毒。在一些方面，慢病毒以约0.25至约20的感染复数(moi)添加。在一些方面，慢病毒以约1至约4的moi添加。在一些方面，慢病毒以约2或约4的moi添加。在一些方面，在步骤(d)之后细胞培养基的体积增加。在一些方面，细胞培养基的体积增加至少6倍。
4、在一些方面，步骤(e)中的培养基每天至少更换一次。在一些方面，步骤(e)中的培养基每12小时更换。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。在一些方面，car结合steap2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)。在一些方面，car编码结合steap2的抗原结合结构域，并且其中该抗原结合结构域包含：
5、(a)包含seq id no：1中所示氨基酸序列的vl-cdr1，包含seq id no：2中所示氨基酸序列的vl-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD3+T细胞；(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞；以及(f)收获这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞。
2.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)获得包含CD3+T细胞群的样品；(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；以及(f)收获这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞。
3.一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该培养基进一步包含人白细胞介素2(IL-2)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中部分(d)包括用包含编码CAR的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中部分(d)包括用包含编码TCR的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生TCR细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中在该培养基中培养约1x106至约1x109个CD3+T细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的CD3+T细胞培养约一天或约两天。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的CD3+T细胞用CD2、CD3、CD28或其任何组合的激动剂激活。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的CD3+T细胞用磁性微珠激活。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的CD3+T细胞用抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段激活。
13.如权利要求12所述的方法，其中该抗CD3抗体或其CD3结合片段和该抗CD28抗体或其CD28结合片段与磁性微珠偶联。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中这些CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。
16.如权利要求15所述的方法，其中这些CAR-T T细胞在步骤(e)中培养约四天。
17.如权利要求15所述的方法，其中这些CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)中培养约六天。
18.如权利要求4至17中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.01U/mL至约0.3U/mL，并且人IL-2的浓度为约5IU/mL至约100IU/mL。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中人IL-21的浓度为约0.19U/mL。
20.如权利要求19所述的方法，其中人IL-2的浓度为约40IU/mL。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间搅动这些CD3+T细胞。
22.一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成CD3+T细胞群；(b)在包含浓度为40IU/mL的人白细胞介素2和浓度为0.19U/mL的人白细胞介素21的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)用包含抗CD3抗体或其CD3结合片段和抗CD28抗体或其CD28结合片段的磁珠激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的...
【技术特征摘要】
1.一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd3+t细胞；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。
2.一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)获得包含cd3+t细胞群的样品；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。
3.一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在含有人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获这些car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该培养基进一步包含人白细胞介素2(il-2)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中部分(d)包括用包含编码car的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中部分(d)包括用包含编码tcr的核酸的载体转导这些cd3+t细胞以产生tcr细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中在该培养基中培养约1x106至约1x109个cd3+t细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该样品是通过白细胞单采术收集的富集的单采术产物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将步骤(c)中的cd3+t细胞培养约一天或约两天。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的cd3+t细胞用cd2、cd3、cd28或其任何组合的激动剂激活。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的cd3+t细胞用磁性微珠激活。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的cd3+t细胞用抗cd3抗体或其cd3结合片段和抗cd28抗体或其cd28结合片段激活。
13.如权利要求12所述的方法，其中该抗cd3抗体或其cd3结合片段和该抗cd28抗体或其cd28结合片段与磁性微珠偶联。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中这些car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中这些car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。
16.如权利要求15所述的方法，其中这些car-t t细胞在步骤(e)中培养约四天。
17.如权利要求15所述的方法，其中这些car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约六天。
18.如权利要求4至17中任一项所述的方法，其中人il-21的浓度为约0.01u/ml至约0.3u/ml，并且人il-2的浓度为约5iu/ml至约100iu/ml。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中人il-21的浓度为约0.19u/ml。
20.如权利要求19所述的方法，其中人il-2的浓度为约40iu/ml。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间搅动这些cd3+t细胞。
22.一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在包含浓度为40iu/ml的人白细胞介素2和浓度为0.19u/ml的人白细胞介素21的培养基中培养这些cd3+t细胞；(c)用包含抗cd3抗体或其cd3结合片段和抗cd28抗体或其cd28结合片段的磁珠激活这些cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的慢病毒载体病毒转导这些cd3+t细胞以产生car-t细胞；(e)将这些car-t细胞在培养基中培养约四天；以及(f)收获这些car-t细胞。
23.如权利要求3至22中任一项所述的方法，其中通过阳性选择分离这些cd4+和cd8+t细胞。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、转座子、dna载体、mrna、脂质纳米颗粒(lnp)或crispr-cas系统。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中该载体是慢病毒。
26.如权利要求25所述的方法，其中该慢病毒以约0.25至约20的感染复数(moi)添加。
27.如权利要求26所述的方法，其中该慢病毒以约1至约4的moi添加。
28.如权利要求27所述的方法，其中该慢病毒以约2或约4的moi添加。
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋金林，C·格里戈里亚杜，N·朱，E·博斯科，G·穆迪，M·L·贾迪诺托尔基亚，A·邦丹扎，
申请(专利权)人：免疫医疗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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