【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程与干细胞技术交叉领域，具体涉及一种表达lgals9的通用型细胞及其制备方法。
技术介绍
1、通过细胞的体外培养或干细胞的诱导分化，能够在体外大量的再生健康的功能细胞，能够通过异体功能细胞移植治疗疾病，但是，免疫不相容和移植细胞遭受的免疫排斥仍然是其临床应用的关键障碍。干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)和成体干细胞(adult stem cell)。人类胚胎干细胞(hesc)和诱导多能干细胞(ipsc)具有无限增殖、自我更新和分化到各种类型细胞的潜力，在治疗癌症、神经相关、心血管等疾病具有重要应用前景。
2、移植自体细胞治疗可以回避免疫排斥问题，但是从病人身上制造自体细胞成本高昂且制备流程周期长(khera et al.，2013)，并且个体来源的细胞产品的质量和有效性不确定。有数据表明病人体内的细胞与正常人的存在差异，治疗效果可能受影响。
3、可通过免疫抑制药物、hla匹配和基因编辑来降低免疫原性，或降低宿主免疫系统对异体移植细胞的排斥反应。免疫抑制药物副作用大，会导致骨髓抑制、肝毒性、脱发和胃肠道不良反应。现在美国、日本、中国都在建立hla匹配的ipsc库，但建库和维护都需要高额的成本，因为hla抗原的基因是在人类基因组中观察到的最具多态性的基因。目前各地的ipsc库无法为各自国
4、人类的主要组织相容性复合体(mhc)，即人白细胞抗原(hla)，是导致免疫不相容的主要原因。hla复合体由一系列基因组成，可分为i类、ii类和iii类。mhc-i基因在几乎所有的组织细胞类型中表达，表达“非己”mhc-i类分子的移植细胞将刺激cd8+t细胞的活化而被消除。cd4+辅助t细胞识别“非己”细胞的mhc-ii基因，从而进行免疫排斥，而iii类分子不参与免疫活动。使用基因编辑的方法改变免疫原性元件，以产生低免疫原性细胞，使得具备免疫豁免性的“off-the-shelf”细胞治疗产品的大规模制造成为可能。
5、近年已有先驱报道通过敲除b2m、ciita等基因，实现mhc-i和mhc-ii细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸t/b细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型pscs，为更广泛的通用型pscs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。然而，hla分子是自然杀伤细胞(nk细胞)的主要抑制性配体，mhc-i类阴性细胞易受天然杀伤(nk)细胞裂解。体内外数据均显示宿主nk细胞可消除植入的b2m-/-供体细胞(flahou et al.，2021)。因此，需要改善先前的方法以产生可以避免免疫反应的通用供体细胞。
6、人体免疫系统能识别并攻击非自身抗原，从而抵抗感染。因此在异体器官移植过程中，免疫系统会攻击移植的器官，导致免疫排斥和移植失败。虽然胚胎和胎盘是半同种异体移植物，类似于移植的器官，但它们可以诱导母体耐受，并且不会产生强烈的免疫反应。胎盘高表达的hla-g通过与蜕膜自然杀伤细胞相互作用调节母胎耐受，同时在胎盘中也检测到cd47高表达(liu et al.,2021；than et al.,2019)。另一方面，肿瘤细胞可逃逸免疫监视已经众所周知，其通过减少hla的表达，减少抗原呈递，从而阻止它们被免疫细胞识别；并增加表达免疫抑制成分如hla-g、pd-l1和ctla-4等(barnet etal.,2018；bogomiakovaet al.,2019；de charette and houot,2018)。
7、已有一些研究探索母胎免疫耐受，肿瘤免疫逃逸与器官移植之间的关系(sun etal.,2021)。已报道模拟母胎耐受和肿瘤逃逸机制在破坏mhc-i和mhc-ii类基因表达的基础上使细胞表达hlag等非经典hla-i类分子，或表达pd-l1、ctla4-ig、cd47、cd24等免疫抑制检查点蛋白，对nk细胞表现出一定的免疫耐受保护(zhao，w.etal.，2020；ye，q.et al.，2020)。
8、然而，这些方案存在仅基于领域已知常识明星分子的直接应用，而免疫逃逸和耐受大多依赖于免疫抑制受体-配体结合，而且在肿瘤状态或母胎界面具有特定的微环境。低免因子的跨领域直接应用于异体移植存在不确定性，配对受体或配体是否存在于移植细胞和免疫细胞上，移植环境是否满足逃逸条件？怀孕的母胎中是什么状态，可能和器官移植时的状态时不同的，因此，现有技术存在免疫兼容性不彻底、不明确或缺乏持久性、有效剂量窗口窄等技术问题。且到目前为止，母胎免疫耐受和肿瘤逃逸的潜在分子机制仍在不断摸索，持续发现的新基因可以进一步开发低免疫原性细胞(barnet et al.,2018)。由此表明需要筛选出更多新的分子来实现更优化的改造干细胞，以获得更优的免疫豁免性方案。
9、参考文献：
10、de charette,m.,and houot,r.(2018).hide or defend,the two strategiesof lymphoma immune evasion:potential implications forimmunotherapy.haematologica 103,1256-1268.
11、liu,y.,gao,s.,zhao,y.,wang,h.,pan,q.,and shao,q.(2021).decidualnatural killer cells:a good nanny at the maternal-fetal interface duringearly pregnancy.front immunol 12,663660.
12、than,n.g.,hahn,s.,rossi,s.w.,and szekeres-bartho,j.(2019).editorial:fetal-maternal immune interactions in pregnancy.front immunol 10,2729.
13、zhao,w.,lei,a.,tian,l.,wang,x.,correia,c.,weiskittel,t.,li,h.,trounson,a.,fu,q.,yao,k.,et al.(2020).strategies for genetically engineeringhypoimmunogenic universal pluripotent stem cell本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通用型细胞，其特征在于，相对于野生型细胞，包含：
2.根据权利要求1所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞包括MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达降低或不表达。
3.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达：DUX4，CD27，CD35，CD200，HLA-C，PD-L1，CD47，CD24，CD26，，CCL21，Mfge8和SerpinB9。
4.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中使用基因编辑工具靶向编码MHC-I的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，来实现MHC-I和/或MHC-II基因的表达降低或不表达；
5.根据权利要求4所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活CIITA基因的稀有切割核酸内切酶靶向CIITA基因的遗传修饰。
6.根据权利要求1-5任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活B2M基因的稀有切割核酸内
7.根据权利要求5或6所述的通用型细胞，其特征在于，所述稀有切割核酸内切酶选自CAS蛋白，TALE-核酸酶，锌指核酸酶，大核酸酶和归巢核酸酶。
8.根据权利要求7所述的通用型细胞，其特征在于，其中通过稀有切割内切核酸酶靶向CIITA基因或B2M基因的遗传修饰包括CAS蛋白或编码CAS蛋白的多核苷酸，和至少一个用于特异性靶向CIITA基因或B2M基因的导向核糖核酸序列。
9.根据权利要求8所述的通用型细胞，其特征在于，使用CRISPR/CAS9系统分别对B2M和CIITA外显子区段进行两端直接敲除，其中，针对B2M基因的导向核糖核酸序列gRNA的靶序列为SEQ ID NO:2和3，针对CIITA基因的导向核糖核酸序列gRNA的靶序列为SEQ ID NO:4和5。
10.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中通过引入针对编码MHC-I的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，或编码MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现MHC-I和/或MHC-II基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自siRNA，shRNA，microRNA，反义RNA和另一种RNA介导的抑制分子中的一种。
11.根据权利要求1-10任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述LGALS9的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示的序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性；
12.根据权利要求1-11任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞是胚胎干细胞或多能干细胞；优选为低免疫原性干细胞；进一步优选为人类干细胞或人类体细胞。
13.一种权利要求1-12任一项所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
14.根据权利要求13所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，所述MHC-I的转录调节因子选自：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白(Tapasin)或NLRC5中的一个或多个；所述MHC-II的转录调节因子选自：CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP中的一个或多个；优选地，所述转录调节因子选自B2M和CIITA。
15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过选择性灭活CIITA基因或B2M基因的稀有切割核酸内切酶靶向CIITA基因或B2M基因的遗传修饰；
16.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过引入针对编码MHC-I的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现MHC-I和/或MHC-II基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自siRNA，shRNA，microRNA，反义RNA和另一种RNA介导的抑制分子中的一种。
17.根据权利要求13-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)采用表达载体将编码LGALS9蛋白的核酸序列引入细胞中；
18.根据权利要求13-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)将编码LGALS9蛋白的核酸序列导入所述干细胞的选定位点；优选地，所述干细胞的选定位点是安全港基因位点。
19.根据权利要求...
【技术特征摘要】
1.一种通用型细胞，其特征在于，相对于野生型细胞，包含：
2.根据权利要求1所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞包括mhc-i和mhc-ii人类白细胞抗原的表达降低或不表达。
3.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达：dux4，cd27，cd35，cd200，hla-c，pd-l1，cd47，cd24，cd26，，ccl21，mfge8和serpinb9。
4.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中使用基因编辑工具靶向编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达；
5.根据权利要求4所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活ciita基因的稀有切割核酸内切酶靶向ciita基因的遗传修饰。
6.根据权利要求1-5任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活b2m基因的稀有切割核酸内切酶靶向b2m基因的遗传修饰。
7.根据权利要求5或6所述的通用型细胞，其特征在于，所述稀有切割核酸内切酶选自cas蛋白，tale-核酸酶，锌指核酸酶，大核酸酶和归巢核酸酶。
8.根据权利要求7所述的通用型细胞，其特征在于，其中通过稀有切割内切核酸酶靶向ciita基因或b2m基因的遗传修饰包括cas蛋白或编码cas蛋白的多核苷酸，和至少一个用于特异性靶向ciita基因或b2m基因的导向核糖核酸序列。
9.根据权利要求8所述的通用型细胞，其特征在于，使用crispr/cas9系统分别对b2m和ciita外显子区段进行两端直接敲除，其中，针对b2m基因的导向核糖核酸序列grna的靶序列为seq id no:2和3，针对ciita基因的导向核糖核酸序列grna的靶序列为seq id no:4和5。
10.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中通过引入针对编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自sirna，shrna，microrna，反义rna和另一种rna介导的抑制分子中的一种。
11.根据权利要求1-10任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述lgals9的氨基酸序列与如seq id no:1所示的序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性；
12.根据权利要求1-11任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞是胚胎干细胞或多能干细胞；优选为低免疫原性干细胞；进一步优选为人类干细胞或人类体细胞。
13.一种权利要求1-12任一项所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
14.根据权利要求13所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，所述mhc-i的转录调节因子选自：b2m、tap1、tap2、tap相关糖蛋白(tapasin)或nlrc5中的一个或多个；所述mhc-ii的转录调节因子选自：ciita、rfxank、rfx5、rfxap中的一个或多个；优选地，所述转录调节因子选自b2m和ciita。
15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过选择性灭活ciita基因或b2m基因的稀有切割核酸内切酶靶向ciita基因或b2m基因的遗传修饰；
16.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过引入针对编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自sirna，shrna，microrna，反义rna和另一种rna介导的抑制分子中的一种。
17.根据权利要求13-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)采用表达载体将编码lgals9蛋白的核酸序列引入细胞中；
18.根据权利要求13-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)将编码lgals9蛋白的核酸序列导入所述干细胞的选定位点；优选地，所述干细胞的选定位点是安全港基因位点。
19.根据权利要求13-18任一项所述的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：士泽生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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