【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于功能酶筛选，涉及一种来源于日本裂殖酵母(schizosaccharomyces japonicus)yfs275的酮还原酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和重组细胞，以及它们的制备方法及其在制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
技术介绍
1、(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((r)-chbe)是一种重要的手性醇，氯原子被三甲胺取代并碱解后生成的中间体是用于制备l-左旋肉碱及其衍生盐等(例如l-左旋肉碱酒石酸盐类)的重要前体物质，而l-左旋肉碱作为药剂、食品添加剂(如添加至婴幼儿三期配方奶粉)、运动健身饮品等被广泛应用，凸显了(r)-chbe作为其制备前体的重要意义。(r)-chbe的制备通常依赖于合成的手性催化剂催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化得到。然而，这样的工艺存在着使用合成相对困难的由稀有金属制备的催化剂，并且成本较高的问题。因此，人们意图采用发酵和生物转化的形式实现全细胞系统进行生产。
2、酮还原酶可以催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，在催化过程中需要用到还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)作为辅因子。目前通过发酵和生物转化还没有实现(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的大规模生产，且在现有酶催化反应中需要添加一定量的有机溶剂，然而生物酶的蛋白质结构对有机溶剂的耐受情况多有不同且有限，所以仍然需要寻求一种(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯基因工程菌株使得其能表达具有较高催化活性并且对有机溶剂有相对较高的耐受性的酮还原酶。
1、本专利技术的目的在于提供一种酮还原酶及其突变体，从而解决现有的酮还原酶催化合成(r)-chbe中存在的酶活性和有机溶剂耐受性不高的问题。
2、具体地，本专利技术从日本裂殖酵母(schizosaccharomyces japonicus)yfs275菌株中获得酮还原酶kredsj，其氨基酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列如seq id no:2所示，并通过易错pcr技术进一步对其突变，得到一种在酶活性和有机溶剂耐受性方面得到显著改善的酮还原酶突变体kredsj-m，其氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seqid no:4所示。
3、在第一方面，本专利技术提供一种具有seq id no:1所示的氨基酸序列的酮还原酶。
4、本专利技术提供的上述酮还原酶可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
5、在一些实施方案中，上述酮还原酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建重组的基因工程菌株，然后进行培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶。
6、在第二方面，本专利技术提供一种编码上述酮还原酶的核酸分子，其具有seq id no:2所示的核苷酸序列。
7、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
8、在第三方面，本专利技术提供上述酮还原酶的突变体，其具有seq id no:3所示的氨基酸序列，其催化活力、有机溶剂耐受性以及转化率与上述酮还原酶相比有进一步提高。与seq id no:1所示的酮还原酶的氨基酸序列相比，该突变体具有如下突变：第28位的l突变为s，第95位的n突变为s，第175位的f突变为v、第240位的y突变为h、第280位的r突变为g。
9、本专利技术提供的上述突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
10、在一些实施方案中，上述突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建重组基因工程菌，然后进行培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶突变体。
11、在第四方面，本专利技术提供一种编码上述酮还原酶突变体的核酸分子，其具有seqid no:4所示的核苷酸序列。
12、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
13、第五方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
14、在一些实施方案中，上述重组载体为pet-kredsj或pet-δkredsj-m57，分别是将编码上述酮还原酶的核酸分子或上述酮还原酶突变体的核酸分子替换pet-28a(+)的bamhi和hindiii酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
15、在第六方面，本专利技术提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
16、在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
17、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
18、将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
19、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主e.colibl21(de3)。
20、在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌se和重组菌57，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达酮还原酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本专利技术的酮还原酶或其突变体的培养基，优选tb培养基。
21、培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并于18℃条件下诱导表达酮还原酶及其突变体。
22、在第七方面，本专利技术提供一种酮还原酶或其突变体的制备方法，包括：
23、对上述任一所述的重组细胞进行培养并加入诱导剂诱导，得到培养物；
24、从所述培养物中分离上述酮还原酶或酮还原酶突变体；
25、其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将酮还原酶及其突变体从培养物中分离出来的方法均为本领域的常规方法。
26、在第八方面，本专利技术提供上述酮还原酶、上述任一所述的核酸分子、上述酮还原酶的突变体、上述重组载体、上述重组细胞和上述方法制备的酮还原酶及其突变体在制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
27、在第九方面，本专利技术提供一种(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的制备方法，包括：以上述酮还原酶、上述酮还原酶突变体、上述重组细胞或上述方法制备得到的酮还原酶或其突变体作为催化剂，对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，使其转化为(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯可进一步用于左旋肉碱及其衍生盐的制备。
28、在一些实施方案中，上述催化反应中，温度为25-35℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，或这些数值中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酮还原酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的酮还原酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的酮还原酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的酮还原酶的突变体的核酸分子，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种酮还原酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：
8.权利要求1所述的酮还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的酮还原酶的突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的酮还原酶或其突变体在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
9.一种(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，包括以下步骤：以权利要求1所述的酮还原酶、权利要求3所述的酮还原酶的
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述催化的反应温度为25-35℃，pH6.0-7.0，反应体系包含4-氯乙酰乙酸乙酯、异丙醇和NADH；
...【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其具有seq id no:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的酮还原酶的核酸分子，其具有seq id no:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的酮还原酶的突变体，其具有seq id no:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的酮还原酶的突变体的核酸分子，其具有seq id no:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种酮还原酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：
8.权利要求1所述的酮还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，姜君鹏，王竞辉，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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