本发明专利技术涉及基于ＲＴ－ＰＣＲ方法的试剂盒及其使用方法。一种甲型肝炎病毒核酸荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，它的引物和探针序列如下：上游引物：５’－ＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＡＡ－３’下游引物：５’－ＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧ－３’探针：５’－ＦＡＭ－ＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＣ－ＴＡＭＲＡ－３’本发明专利技术方法对甲型肝炎病毒的检测有高度的特异性，灵敏度达０．１ＴＣＩＤ５０，可直接双壳贝类如毛蛤、牡蛎等生物等标本中检测甲型肝炎病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需３ｈ左右。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及甲型肝炎病毒的检测试剂盒及其使用方法，具体涉及基于RT-PCR方 法的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
甲肝病毒(h印atitis Avires, HAV)是广泛传播的肝炎致病因子，它主要通过粪 一口消化道途径引起人类感染。是全球急性传染性肝炎的主要原因，它可以引起甲型肝炎 暴发与流行。甲肝传染源为急性期的病人和亚临床感染者，他们的粪便、尿液、呕吐物都可 能污染周围环境、食物、水源等，被污染过的食物、水、各种物品充当传染媒介。因近岸贝类 养殖区和海水浴场受到陆源生活污染水污染引发甲肝流行的事件，在国内外都有过许多报 道。由于甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，为了对该病迅速查明病因，及时采取 控制措施，急需进行实验室快速诊断，但传统甲肝病毒的检测方法是通过细胞培养，可是甲 肝病毒不仅增殖周期长、增殖能力低，且不形成细胞病变，难以满足检测的要求，不适合早 期诊断。申请号为200910010804. 9的中国专利公开了水产品中3种食源性病毒检测试剂 盒及其检测方法。该试剂盒中包括浓度为5υ/μ L的反转录-TagDNA聚合酶、浓度为5U/μ L 的反转录酶及RT-PCR反应液；其中的RT-PCR反应液中含有IOmM Tris 'HCUSOmM KCl、25mM MgCl2^dNTP各10mM、RNA酶抑制剂40U/ μ L及3种食源性病毒的上下游引物对各20 μ M ；所述的引物序列如下 该专利技术专利的缺点是特异性程度不高，会出现假阳性。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是针对上述技术缺陷，提供一种快速检测甲型肝炎病毒的甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本专利技术具有特异性程度高的优点。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案实现的一种甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，它的引物和探针序列如下上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3， 下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探针5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，。此外本试剂盒中还包括dNTP，MgCl2, RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些 组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。本专利技术的另外一个目的是提供一种上述甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测 试剂盒的使用方法。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的一种上述甲型肝炎病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，它包括以 下步骤(1)根据甲型肝炎病毒基因序列，设计引物和探针序列如下上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3，下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探针5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，；(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针 序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度 判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有甲型肝炎病毒核酸。本专利技术关键在于引物和探针序列的设计，荧光RT-PCR反应体系组成、反应条件选 择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。优选的，所述荧光定量RT-PCR反应体系每25 μ L组成如下RT-PCR缓冲液终浓度为1 XExTaq HS (5U/ μ L)(0. IU/ μ L)RT Enzyme Mix II(0. IU/ μ L)上游与下游引物各1. 60 μ M探针1.20 μ M模板 RNA8 μ L DEPC 水补足至 25 μ L。所述RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1 X，是指缓冲液各组 分在反应体系中的终浓度与IXone step RT-PCR中各组分的浓度相同。通常采用反应体 系 1/2 体积的 2Xone step RT-PCR0优选的，所述荧光定量RT-PCR反应条件为42°C 30min,95°C 2min进行逆转录，然 后95°C 15s，52°C lmin，在52°C进行单点荧光检测，共进行40个循环。所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，对甲型肝炎爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。目前甲型肝炎检测的几种方法中常规细胞培养 进行病毒分离法虽然正确可靠，但繁杂耗时，不适应早期应急诊断；20世纪80年代建立的 RT-PCR和ICC/PCR(integratedcellculture，PCR)检测技术提高了检测的灵敏度和特异 性，且大大缩短了检测时间，目前已在甲型肝炎病毒的核酸检测中得到应用，但是需依据放 射性物质标记的DNA探针或通过凝胶电泳中的特定DNA条带来判断检测结果，不仅费时费 力，且给使用带来很大不便近。而且容易因PCR扩增产物污染而产生假阳性。因此目前对甲 肝病毒的检测主要采用酶联免疫吸附实验(ELISA)，而该法只能检测到病毒抗原，对含空泡 病毒(无核酸)比例很高(50%左右)的甲肝病毒来说，并不能反应活性病毒的多少，且不 能确定HAV在检测时一定存在。况且在临床上患者血清中抗甲肝IgG或IgM于发病数日的 黄疸前期才可检出。由于患者临床就诊与采血的时间往往处在发病初期，故在临床上用IgG 或IgM抗体作为诊断手段不可避免地形成一定程度上的漏检。然而甲肝最危险的传染源不 是明确发病的急性黄疸型肝炎患者，而是无黄疸型、隐性感染者，因症状不明显，常被忽视， 这些人群约占甲型肝炎的50 % 90 %。尤其是儿童几乎都是无黄疸型肝炎，隐蔽性极强， 但是他们都在不知不觉中向外界排放甲型肝炎病毒。而采用甲型肝炎病毒核酸检测技术， 非常适用于甲型肝炎的早期诊断(不但可用于现症病人的早期诊断，可从含有10 100个 病毒颗粒的粪便标本中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA)，还可用于亚临床感染者和隐性 感染者的检测以及水、水产品等环境污染HAV的检测，也是进行流行病研究的重要手段，在 方法学上能提高甲型肝炎病毒的检出率。 近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管 式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RT-PCR技术，无论从敏感性，特 异性与速度上都更具有优势，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。本申请专利技术人从美国的NCBI基因库上下载了近几十年来世界各地的甲型肝炎病 毒毒株，对其进行了同源性比较，在甲型肝炎病毒的保守区设计若干对引物与Taqman探 针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行 优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经甲型肝炎病毒标准株、肠道病毒株与实际样本的 检测比较，该方法具有高特异性，只能检出甲型肝炎病毒，与其他肠道病毒如脊髓灰质炎病 毒、乙型脑炎病毒、腺病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇Al以及柯萨奇B5病毒株等毒株 均无交本文档来自技高网...
【技术保护点】
甲型肝炎病毒核酸荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于，它的引物和探针序列如下：上游引物：５’－ＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＡＡ－３’下游引物：５’－ＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧ－３’探针：５’－ＦＡＭ－ＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＣ－ＴＡＭＲＡ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩建康，徐德顺，吴晓芳，纪蕾，
申请(专利权)人：湖州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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