【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种生产聚-3-羟基丁酸酯的工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、聚-3-羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，pbh)是pha家族中最简单，也是研究的最多、最透彻的成员。pha(b)在细胞内呈颗粒状，分子量一般为10(随培养条件抽提方法不同而变化)，熔点为18℃，具有高结晶性、光学活性和压电性质，是立体规整的聚合物。与常用的热塑性塑料相比较pha(b)有相对较高的e模量在室温下抗冲击强度较低，在低压力下不能延伸。最近，pha(b)与中链脂肪酸的共聚物pha(b)-co-pha由于在机械性能上有很大程度的提高，成为国际上研究的热点。聚-3-羟基丁酸酯(pha(b))是一种重要的碳中性生物聚合物，可以取代石油衍生塑料，因为它具有优异的热化学性能、生物相容性和生物降解性。
2、乙酰辅酶a是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。三大营养物质可通过乙酰辅酶a汇聚成一条代谢通路—三梭酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路可彻底氧化成co2和h2o并放出大量能量，供给生物体。它是合成脂肪酸、酮体等能源物质的前体物质，也是合成胆固醇及其行生物等生理活性物质的前体物质。
3、pha(b)的合成途径已经比较清楚。以葡萄糖为原料，可以通过乙酰辅酶a缩合形成聚合物的前体物酰基辅酶a，然后在聚合酶的作用下合成pha(b)。
4、现有的化学合成法存在原料成本高、反应条件苛刻、设备要求高、产品收率低以及污染环境等问题，其应用受到一定限制。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种生产聚-3-羟基丁酸酯的工程菌群及其构建方法和应用，反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高，能够有效提高聚-3-羟基丁酸酯的产量和转化率。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种工程菌群的构建方法，所述构建方法包括：
4、敲除受体菌的乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因；
5、导入phaa基因、phab基因、phac基因和丙酮酸脱氢酶基因；
6、所述受体菌为含有所述乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因的细菌或真菌。
7、本专利技术改造后的酿酒酵母工程菌利用葡萄糖等碳源进行发酵培养时，碳源转化形成乙酰辅酶a，可用于第二阶段的发酵，改造后的大肠杆菌工程菌利用葡萄糖和乙酰辅酶a进行发酵培养时，并在发酵液中积累，在乙酰辅酶a产生菌酿酒酵母工程菌和pha(b)合成菌大肠杆菌工程菌的基础上，利用葡萄糖为发酵底物生产pha(b)，能够有效提高聚3-羟基丁酸酯的产量和产率。
8、优选地，所述受体菌包括：酿酒酵母菌和/或大肠杆菌。
9、优选地，所述酿酒酵母菌和大肠杆菌的质量比为(1-3):(1-3)。
10、上述1-3中的具体点值可以选择1、2、3等。
11、优选地，所述敲除受体菌的乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因上下游同源臂的dna片段实现。
12、优选地，所述含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因上下游同源臂的dna片段的核酸序列包括如seq id no.9-seq id no.11所示的序列。
13、seq id no.9：
14、actactgctttactgtctcacaatgtctctgattggaagatacctaagaaaattatttaactacatatctacaaaatcaaagcatcatgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggctattgtcttttatgagacagatggaaaattggaatataaagacgtcacagttccggaacctaagcctaacgaaattttagtccacgttaaatattctggtgtttgtcatagtgacttgcacgcgtggcacggtgattggccatttcaattgaaatttccattaatcggtggtcacgaaggtgctggtgttgttgttaagttgggatctaacgttaagggctggaaagtcggtgattttgcaggtataaaatggttgaatgggacttgcatgtcctgtgaatattgtgaagtaggtaatgaatctcaatgtccttatttggatggtactggcttcacacatgatggtacttttcaagaatacgcaactgccgatgccgttcaagctgcccatattccaccaaacgtcaatcttgctgaagttgccccaatcttgtgtgcaggtatcactgtttataaggcgttgaaaagagccaatgtgataccaggccaatgggtcactatatccggtgcatgcggtggcttgggttctctggcaatccaatacgcccttgctatgggttacagggtcattggtatcgatggtggtaatgccaagcgaaagttatttgaacaattaggcggagaaatattcatcgatttcacggaagaaaaagacattgttggtgctataataaaggccactaatggcggttctcatggagttattaatgtgtctgtttctgaagcagctatcgaggcttctacgaggtattgtaggcccaatggtactgtcgtcctggttggtatgccagctcatgcttactgcaattccgatgttttcaatcaagttgtaaaatcaatctccatcgttggatcttgtgttggaaatagagctgatacaagggaggctttagatttcttcgccagaggtttgatcaaatctccgatccacttagctggcctatcggatgttcctgaaatttttgcaaagatggagaagggtgaaattgttggtagatatgttgttgagacttctaaatgatcttttgtaacgaatttgatgaatatatttttactttttatataagctat。
15、seq id no.10：
16、ggtgctctgactgcattattacgtgacgctataaagcctaacttaatgcaaactttggaagggacccccgtaatggttcacgctggtcctttcgccaacatctccatcggcgcatcatcagtaattgcagacttaatggcattgaagcttgttggttcagaaaagaacccgttaaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程菌群的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述受体菌包括：酿酒酵母菌和/或大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌和大肠杆菌的质量比为(1-3):(1-3)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述敲除受体菌的乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因的上下游同源臂的DNA片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括FRT+抗性基因氨苄+FRT。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因上下游同源臂的DNA片段的核酸序列包括如SEQ ID No.9-SEQ IDNo.11所示的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述phaA基因、phaB基因、phaC基因的来源包括：真养产碱杆菌和/或富养罗尔斯通氏菌；
7.根据权利要求1-6中
8.一种基因工程菌群，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求1-8中任一项所述的构建方法构建得到。
9.权利要求8所述的基因工程菌群在生产聚-3-羟基丁酸酯或制备生产聚-3-羟基丁酸酯产品中的应用。
10.一种生产聚-3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述方法包括以葡萄糖为碳源，利用权利要求8所述的基因工程菌群进行生物转化，制备聚-3-羟基丁酸酯。
...【技术特征摘要】
1.一种工程菌群的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述受体菌包括：酿酒酵母菌和/或大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌和大肠杆菌的质量比为(1-3):(1-3)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述敲除受体菌的乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因的上下游同源臂的dna片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括frt+抗性基因氨苄+frt。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有乙醇脱氢酶基因、苹果酸合酶基因和乳酸脱氢酶基因上下游同源臂的dna片段的核酸序列包括如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：温燕丽，
申请(专利权)人：上海沐深新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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