【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物模型构建，具体涉及一种新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法以及利用该模型用于药物筛选和评价的用途。
技术介绍
1、由sars-cov-2病毒引起的新型冠状病毒感染通常会引起气道和肺部症状，严重时会导致呼吸窘迫和死亡。此外，嗅觉和味觉障碍也被认为是新型冠状病毒感染的主要症状之一。嗅觉丧失在轻症和重症的患者中普遍存在，并且很有可能在患者恢复后作为新冠后遗症(long covid)的主要症状长期影响患者的生活(lancet neurol 2021,20,(9),753-761.；trends mol med 2022,28,(9),781-794.)。
2、目前对于新冠导致的嗅觉损伤的研究主要来自对新冠患者样本的研究。已经有研究表明嗅觉上皮细胞的新冠病毒感染会导致炎症，进而损害神经元，减少可用于向大脑发送信号的轴突数量，并导致嗅球功能失调(acs chem neurosci 2021,12,(20),3795-3805.；neuroscientist 2021,27,(6),582-603.)。
3、目前没有针对新型冠状病毒感染的特效药，通过构建sars-cov-2病毒感染导致的嗅觉损伤动物模型用于筛选治疗药物，是关键的方法。目前已经开发出ace2转基因小鼠(nature 2020,583,(7818),830-833.)、叙利亚金仓鼠(sci transl med 2021,13,(596).)等动物的嗅觉损伤模型，然而该类模型存在遗传操作困难、通量小、速度慢等问题，难以用于治
4、斑马鱼由于其高产卵率、胚胎体外受精发育、维护成本低、基因操作容易等优势，在药物筛选领域受到研究者们的青睐。斑马鱼与人类基因同源性约为80％，并且其嗅觉系统的功能和结构组织以及嗅觉转导机制在进化上是保守的。有研究者用sars-cov-2rbd蛋白鼻内给药构建了成年斑马鱼的嗅觉损伤模型，观测到感染后斑马鱼嗅觉器官固有层存在水肿和内皮炎症，出血以及嗅纤毛丧失等表型，并通过嗅觉电生理证明了嗅觉丧失，从而证明了在斑马鱼模型上模拟新冠导致的嗅觉损伤的可行性(brain behav immun 2022,102,341-359.)。但是，利用斑马鱼成鱼构建嗅觉损伤模型存在试验周期长，成本高，通量低等局限。目前仍然缺乏可用于高通量药物筛选的整体动物模型。
5、荧光成像技术是利用激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的光这一原理进行检测。目前常用的荧光基团有绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(ds red)等。活体荧光成像技术可从整体上展示完整的自然状态下的生物，与其他的活体内成像技术相比，荧光成像技术有着敏感度高、安全易操作、结果直观、数据真实可靠、费用低廉等优点，已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等领域。然而斑马鱼成鱼周身不透明，且体型较大，难以实现活体荧光成像，因此难以应用于药物的筛选。
6、因此，构建一种能够结合活体荧光成像技术评价疾病表型且能够用于高通量药物筛选的整体动物模型是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于构建一种sars-cov-2病毒感染导致的嗅觉损伤动物模型，能够用于高通量药物筛选。利用该模型筛选和评价天然产物以及化学合成药物中具有抗新型冠状病毒及嗅神经损伤作用的物质。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，包括：
4、(1)取受精后3～10天的转基因斑马鱼系仔鱼，所述转基因斑马鱼系的gaba能神经元和中性粒细胞具有不同的荧光标记，麻醉后鼻内给予sars-cov-2病毒s1蛋白进行感染，然后复苏；
5、(2)造模3～24小时后，结合活体荧光成像技术挑选荧光强度与未感染比较存在显著性差异的仔鱼即为所述斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型。
6、本专利技术采用sars-cov-2病毒s1蛋白感染斑马鱼鼻腔，使得嗅觉上皮细胞发生炎症，进而损害嗅觉神经元，形成嗅神经损伤模型。通过在gaba能神经元和中性粒细胞上携带荧光标记，结合荧光成像技术可以直观反映gaba能神经元和中性粒细胞在感染前后的变化情况。
7、本专利技术选择受精后3～10天的斑马鱼仔鱼进行造模，此时的斑马鱼通体透明，方便于活体实时荧光成像获取更清晰的图像用于结果分析。研究表明，相较于对照组，造模组嗅神经荧光强度明显减弱且中性粒细胞个数显著增加，该差异具有统计学意义。
8、优选的，选择受精后6～7天的斑马鱼仔鱼进行造模。
9、本专利技术分别在gaba能神经元和中性粒细胞上标记呈现不同荧光颜色的标记。利用gaba能神经元表达强度和中性粒细胞动态招募水平这两个指标对模型进行评价。
10、进一步的，所述转基因斑马鱼系可以为但不限于tg(gad1b：mcherry；lyz：egfp)，该转基因斑马鱼系的gaba能神经元和中性粒细胞分别具有mcherry红色荧光蛋白标记和egfp绿色荧光蛋白标记。
11、进一步的，步骤(1)中，造模前，收集受精后的胚胎转移至含有1～3μm亚甲基蓝以及2～5μm的1-苯基-2-硫脲的e3培养基中孵育。胚胎孵育环境中添加亚甲基蓝可以防治真菌生长，提高孵化率。使用苯硫脲可以抑制斑马鱼胚胎内的黑色素生长，使得斑马鱼胚胎的光学透明度增加，优选的，1-苯基-2-硫脲的浓度为2.5μm。
12、置于28.5℃、光暗时间14h/10h的恒温培养箱中培养，隔天更换培养基。一般在受精后2～3天孵化出仔鱼，继续培养。挑选带有荧光的仔鱼用于造模。
13、进一步的，麻醉的条件为：将仔鱼置于含有60～150μg/ml三卡因的e3培养基中培养，待仔鱼停止游动。优选的，将仔鱼置于含有80μg/ml三卡因的e3培养基中培养10min左右。
14、进一步的，按照单侧鼻孔给予s1蛋白1～5ng的用量进行感染。研究表明，该剂量感染后3～6小时后，斑马鱼仔鱼即表现出嗅觉损伤症状，造模成功。具体的，配制500μg/ml浓度的s1蛋白溶液用于鼻内给药。优选的，单侧鼻孔给予2ng的s1蛋白进行感染。
15、进一步的，鼻内感染的方法为采用显微注射技术在单侧鼻孔给予sars-cov-2病毒s1蛋白，另一侧鼻孔给予无菌磷酸盐缓冲液(pbs)代替s1蛋白作为对照，即在同一个体上设置造模组和对照组。
16、或者将若干斑马鱼仔鱼分成造模组和对照组，造模组的双侧鼻孔内均给予sars-cov-2病毒s1蛋白；对照组的双侧鼻孔内均给予无菌磷酸盐缓冲液。
17、进一步的，注射结束后将仔鱼转入不含有麻醉剂的e3培养基中复苏，培养基中含有1～3μm亚甲基蓝以及2～5μm的1-苯基-2-硫脲，10min左右仔鱼可以正常游动。
18、步骤(2)中，采用活体荧光成像技术筛选造模成功的斑马鱼仔鱼，具体的，对于单侧注射本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，所述转基因斑马鱼系为Tg(gad1b：mcherry；lyz：egfp)。
3.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，收集受精后的胚胎转移至含有1～3μM亚甲基蓝以及2～5μM的1-苯基-2-硫脲的E3培养基中孵育。
4.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，麻醉的条件为：在含有60～150μg/mL三卡因的E3培养基中培养。
5.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，按照单侧鼻孔给予S1蛋白1～5ng的用量进行感染。
6.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，鼻内感染的方法为采用显微注射技术在单侧鼻孔给予SARS-CoV-2病毒S1蛋白，另一侧鼻孔给予无菌
7.如权利要求1所述的新冠病毒S蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，注射结束后将仔鱼转入不含有麻醉剂的E3培养基中复苏。
8.如权利要求1-7任一项所述的构建方法制备得到的斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的用途，其特征在于，包括：利用该模型用于筛选或评价能够预防、治疗新型冠状病毒感染或嗅觉损伤的药物。
9.一种基于如权利要求1-7任一项所述的构建方法制备得到的斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型筛选药效物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，利用荧光成像统计注射侧嗅神经荧光强度时，荧光信号采集区域限于注射侧嗅神经处30×30pixel的范围内；
...【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，所述转基因斑马鱼系为tg(gad1b：mcherry；lyz：egfp)。
3.如权利要求1所述的新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，收集受精后的胚胎转移至含有1～3μm亚甲基蓝以及2～5μm的1-苯基-2-硫脲的e3培养基中孵育。
4.如权利要求1所述的新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，麻醉的条件为：在含有60～150μg/ml三卡因的e3培养基中培养。
5.如权利要求1所述的新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法，其特征在于，按照单侧鼻孔给予s1蛋白1～5ng的用量进行感染。
6.如权利要求1所述的新冠病毒s...
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