【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及高通量基因测序文库的构建方法。
技术介绍
1、人类基因组测序计划完成以来，ngs二代测序技术成本不断降低，该技术在诊断领域的应用也越来越广泛。比如，肿瘤早筛、伴随诊断精准用药、肿瘤预后、未知病原菌检测、产前筛查以及遗传病检测、法医鉴定等领域都依赖于ngs二代测序技术的发展。
2、待检样本在上机测序前，均需经过多步骤的预处理，比如样本采集、样本的核酸提取富集、适用于目标二代测序平台的文库制备、文库均一化处理。诊断应用对于数据的真实性以及低背景噪音要求非常高，而二代测序技术除了测序本身会引入碱基错误而造成假阳性突变外，在样本储存、核酸提取以及文库制备环节均可引入碱基突变、基因融合、结构变异等突变类型，这些人为引入的假阳性突变给真实的突变检测带来了背景噪音，从而造成结果误判。比如肿瘤组织样本采集后经过福尔马林浸泡和石蜡包埋步骤，在这个过程中鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸g可能被脱氨变成尿嘧啶脱氧核糖核苷酸u，然后在文库制备环节经过pcr扩增而变成t，形成了g到t的单碱基突变。核酸提取环节，由于经石蜡包埋的肿瘤组织样本需要经过高温脱蜡处理，在此过程中造成双链解链为单链，这部分单链dna在建库环节可能同其他非互补的单链非特异性的互补配对，再经过末端修复和加da尾的过程和接头连接过程，二代测序也会将这部分序列进行读取，从而产生了人工引入的融合dna序列，经过测序碱基的读取及后续的比对分析被判定为融合或snv从而影响结果的准确性。另外目前诊断领域由于时效性和便捷性的需求越来越高，使用内切酶进行文库构建的应用也越来越广
3、已有文献报道使用单链特异性的核酸外切酶将原始样本中的单链dna切除来消除人工假融合dna序列的产生，然后再经过纯化将这些单链特异性的核酸外切酶去除。该方法一方面会引入额外的操作步骤，增加实验的时间及人力成本；另一方面，核酸外切酶也可能非特异性的降解双链dna，造成原始样本信息的丢失。再者，由于引入了额外的纯化步骤，丢失了一部分模板也会造成后续文库的产量降低。
技术实现思路
1、本申请惊奇地发现在二代测序文库制备过程中添加单链dna结合蛋白可以大大降低原始模板中存在的单链dna非特异的互补配对、以及二代测序文库构建过程产生的单链带来的非特异性互补配对，从而有效地降低二代测序文库中的颠倒嵌合reads比例，降低最终文库中的snv、基因融合及其他结构变异等人工引入的假阳性背景噪音。
2、本申请的第一个方面，提供一种试剂组合，其包含核酸片段化酶和单链dna结合蛋白。
3、在一些实施方案中，所述的试剂组合还包含双链dna末端修复酶。
4、在一些实施方案中，所述的试剂组合还包含加a酶。
5、在一些实施方案中，所述的试剂组合还包含缓冲液。
6、在一些实施方案中，所述单链dna结合蛋白选自t4gp32、reca、tth、tma、tne和etssb中的至少一种；在一些实施方案中，所述的试剂组合包含1至6种选自t4gp32、reca、tth、tma、tne和et ssb的单链dna结合蛋白，具体可以是1种、2种、3种、4种、5种、6种。
7、在一些实施方案中，所述试剂组合包含所述单链dna结合蛋白0.01μg至100μg，例如可以是0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg。
8、在一些实施方案中，所述t4gp32的量为0.1μg至100μg，例如可以是0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg。
9、在一些实施方案中，所述reca的量为0.02μg至100μg，例如可以是0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg。
10、在一些实施方案中，所述tth的量为0.1μg至40μg，例如可以是0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、25μg、30μg、35μg或40μg。
11、在一些实施方案中，所述tma的量为0.02μg至20μg，例如可以是0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg或20μg。
12、在一些实施方案中，所述tne的量为0.04μg至60μg，例如可以是0.04μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种试剂组合，其包含核酸片段化酶和单链DNA结合蛋白。
2.权利要求1所述的试剂组合，其还包含双链DNA末端修复酶。
3.权利要求1所述的试剂组合，其还包含加A酶。
4.权利要求1所述的试剂组合，其还包含缓冲液。
5.权利要求1所述的试剂组合，所述单链DNA结合蛋白选自T4GP32、RecA、Tth、Tma、Tne和ET SSB中的至少一种。
6.权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合包含所述单链DNA结合蛋白0.01μg至100μg。
7.权利要求5所述的试剂组合，所述T4GP32的量为0.1μg至100μg，所述RecA的量为0.02μg至100μg，所述Tth的量为0.1μg至40μg，所述Tma的量为0.02μg至20μg，所述Tne的量为0.04μg至60μg，所述ET SSB的量为0.01μg至60μg。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂组合，其以混合物形式存在或以试剂盒的形式存在。
9.一种基因测序文库的构建方法，包含核酸样本片段化、片段的末端修复、任选地片段加A、
10.权利要求9所述的方法，所述核酸样本片段化包含采用机械打断、化学打断和/或酶切方法对核酸样本进行片段化。
11.权利要求9所述的方法，所述单链DNA结合蛋白选自T4GP32、RecA、Tth、Tma、Tne和ETSSB中的至少一种。
12.权利要求9所述的方法，所述单链DNA结合蛋白的量为0.01μg至100μg。
13.权利要求11所述的方法，所述T4GP32的量为0.1μg至100μg，所述RecA的量为0.02μg至100μg，所述Tth的量为0.1μg至40μg，所述Tma的量为0.02μg至20μg，所述Tne的量为0.04μg至60μg，所述ET SSB的量为0.01μg至60μg。
14.一种试剂组合，其包含单链DNA结合蛋白、双链DNA末端修复酶和缓冲液。
15.权利要求14所述的试剂组合，还包含加A酶。
16.权利要求14所述的试剂组合，所述单链DNA结合蛋白选自T4GP32、RecA、Tth、Tma、Tne和ET SSB中的至少一种。
17.权利要求14所述的试剂组合，所试剂组合包含所述单链DNA结合蛋白0.01μg至100μg。
18.权利要求16所述的试剂组合，所述T4GP32的量为0.1μg至100μg，所述RecA的量为0.02μg至100μg，所述Tth的量为0.1μg至40μg，所述Tma的量为0.02μg至20μg，所述Tne的量为0.04μg至60μg，所述ET SSB的量为0.01μg至60μg。
19.权利要求14-18任一项所述的试剂组合，其以混合物形式存在或以试剂盒的形式存在。
20.单链DNA结合蛋白在制备用于高通量基因测序的文库的试剂中的用途。
21.单链DNA结合蛋白在制备用于降低因高通量基因测序样本中游离单链产生的测序结果假阳性变异的试剂或用于降低因高通量基因测序文库构建过程中产生的游离单链导致的测序结果假阳性变异的试剂中的用途，其中所述测序结果假阳性变异包含位点变异、基因融合和基因颠倒嵌合。
...【技术特征摘要】
1.一种试剂组合，其包含核酸片段化酶和单链dna结合蛋白。
2.权利要求1所述的试剂组合，其还包含双链dna末端修复酶。
3.权利要求1所述的试剂组合，其还包含加a酶。
4.权利要求1所述的试剂组合，其还包含缓冲液。
5.权利要求1所述的试剂组合，所述单链dna结合蛋白选自t4gp32、reca、tth、tma、tne和et ssb中的至少一种。
6.权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合包含所述单链dna结合蛋白0.01μg至100μg。
7.权利要求5所述的试剂组合，所述t4gp32的量为0.1μg至100μg，所述reca的量为0.02μg至100μg，所述tth的量为0.1μg至40μg，所述tma的量为0.02μg至20μg，所述tne的量为0.04μg至60μg，所述et ssb的量为0.01μg至60μg。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂组合，其以混合物形式存在或以试剂盒的形式存在。
9.一种基因测序文库的构建方法，包含核酸样本片段化、片段的末端修复、任选地片段加a、连接接头和扩增的步骤，其特征在于，所述方法包含在所述核酸样本片段化步骤之前、之后和/或核酸样本片段化的同时用单链dna结合蛋白处理核酸样本和/或核酸样本片段化产物。
10.权利要求9所述的方法，所述核酸样本片段化包含采用机械打断、化学打断和/或酶切方法对核酸样本进行片段化。
11.权利要求9所述的方法，所述单链dna结合蛋白选自t4gp32、reca、tth、tma、tne和etssb中的至少一种。
12.权利要求9所述的方法，所述单链dna结合蛋白的量为...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，聂俊伟，瞿志鹏，江明扬，邱翠，刘欣，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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