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改进的嵌合和工程化支架以及多重化抑制性RNA簇制造技术

技术编号:40131181 阅读:12 留言:0更新日期:2024-01-23 22:09
本申请涉及RNA干扰领域,更具体地说,应用于免疫疗法例如过继性细胞疗法(ACT)的RNA干扰。在本文,提出了设计成下调多个靶标的多个shRNA支架的嵌合簇。还提出了包含shRNA的多核苷酸、载体和表达此类shRNA的细胞,单独地或与感兴趣的蛋白如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)组合。这些细胞特别适合用于免疫疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

专利
本申请涉及rna干扰领域,更具体地说,应用于免疫疗法例如过继性细胞疗法(act)的rna干扰。在本文,提出了设计成下调多个靶标的多个shrna支架的嵌合簇。还提出了包含shrna的多核苷酸、载体和表达此类shrna的细胞,单独地或与感兴趣的蛋白如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)组合。这些细胞特别适合用于免疫疗法。


技术介绍

1、在难以有效方式转导的细胞中同时下调多个靶标是一个已知问题。多重基因组工程化方法通常很麻烦。在寻求解决多重基因组工程化遇到的问题时,可以考虑提供敲低而不是基因敲除可能性的系统,这将带来更大的灵活性(例如,时间调控将成为可能)。理想情况下,这些系统也应该不那么麻烦(这样就不需要为每个靶标工程化单独的蛋白,或者可以在单个转导步骤中实现下调),并且应当是足够有效且特异的。

2、可以考虑的一种解决方案是rna干扰(rnai)。植物和动物中存在几种rnai基因调节机制。第一种是通过表达小的非编码rna,称为microrna(微小rna,“mirna”)。mirna能够靶向特定的信使rna(“mrna”)以进行降解,从而促进基因沉默。

3、由于microrna通路在基因活性调节中的重要性,研究人员目前正在探索小干扰rna(“sirna”)能够介导rnai的程度,所述小干扰rna是人工设计的分子。sirna可以引起靶标分子如mrna的切割,与mirna相似,为了识别靶标分子,sirna依赖于碱基的互补性。

4、在称为sirna的分子类别中,有短发夹rna(“shrna”)。shrna是单链分子,含有有义区和能够与有义区杂交的反义区。shrna能够形成茎环结构,其中有义区和反义区构成部分或全部茎。使用shrna的一个优点是它们可以作为一个简单的单一实体进行递送或转录,该实体可以作为单个单元或作为多组分系统的一部分引入,当sirna具有两条分开的链时,这些都是不可能的。然而,与其他sirna一样,shrna仍然基于碱基的互补性靶向mrna。

5、许多病况、疾病和病症是由多种蛋白之间的相互作用引起的。因此,研究人员正在寻找将多个sirna同时递送至细胞或生物体的有效方法。

6、一种递送选择是使用载体技术在细胞中表达shrna,它们将在细胞中通过内源性mirna通路进行处理。为每个shrna使用单独的载体可能很麻烦。因此,研究人员开始探索使用能够表达多个shrna的载体。遗憾的是,报道的文献描述了从单个载体表达多个shrna时的若干挑战。研究人员遇到的问题包括:(a)载体重组和shrna表达丢失的风险;(b)多重盒中的位置效应降低了shrna的功能(例如作为二级结构的结果);(c)shrna克隆的复杂性;(d)rnai加工饱和度;(e)细胞毒性;(f)不期望的脱靶效应。

7、此外,虽然已表明sirna在某些转化的哺乳动物细胞系中的短期基因抑制有效,但其在原代细胞培养物中或用于稳定转录物敲低中的应用证明更具挑战性。已知敲低功效差异很大,范围在<10%至>90%之间(例如taxman等人,2006),因此需要进一步优化。由于表达超过一种抑制剂时功效通常会降低,因此这种优化在这种情况下更为重要。

8、因此,仍然需要开发用于递送多重化rna干扰分子的有效盒和载体。虽然一般来说对于细胞应用确实如此,但在act领域中对此进行的探索较少,并且在这些细胞中高度需要有效的系统。

9、因此,本领域需要提供允许具有多重化靶标敲低的细胞疗法的系统,其不需要多步生产方法(并因此提供相对容易的制造和降低的成本),并提供灵活性(例如通过使变化可逆,允许敲低减弱(例如以避免毒性),或将一个靶标换成另一个靶标)。


技术实现思路

0、专利技术概述

1、令人惊讶的是,本文证明了shrna不仅可以在细胞中、特别是在工程化免疫细胞中成功地多重化,而且还通过利用mir-17mirna家族簇(即mir-17-92旁系同源物之一)的支架,特别是诸如在mir-106a~363簇、mir-17~92簇、mir106b-25簇及其组合、特别是其嵌合组合中发现的支架,非常有效地下调多个靶标。嵌合组合可以是嵌合簇(其中来自这三个不同簇的支架用于创建新簇)或嵌合支架(其中至少支架的下部茎部分来自与上部茎和/或环部分不同的mirna),或这两者的组合。

2、因此,本专利技术的目的在以下项中提供:

3、1.一种核酸分子,其包含至少一个具有工程化支架的rna干扰分子,其中所述工程化支架包含下部茎区和上部茎/环区,并且其中所述支架的下部茎区是来自mir-17家族簇的mir支架的下部茎区,并且其中所述支架的至少部分的上部茎/环区已被工程化以不同于野生型/天然序列。

4、2.根据项1所述的核酸分子,其中所述工程化支架的下部茎区选自mir-17支架、mir-18a支架、mir-19a支架、mir-20a支架、mir-19b-1支架、mir-92-1支架、mir-106a支架、mir-18b支架、mir-20b支架、mir-19b-2支架、mir-92-2支架、mir-363支架、mir-106b支架、mir-25支架和mir-93支架。

5、3.根据项1或2所述的核酸分子,其中所述工程化支架是嵌合支架,并且其中至少部分的所述上部茎/环区不是来自与下部茎区相同的mir支架,并且其中所述至少部分的所述上部茎/环区选自mir-17支架、mir-20a支架、mir-106a支架、mir-20b支架、mir-106b支架和mir-93支架。

6、4.根据项1至3中任一项所述的核酸分子,其中所述至少一个rna干扰分子是至少两种多重化rna干扰分子。

7、5.一种核酸分子,其包含具有不同支架的至少两个rna干扰分子,其中至少两种不同支架具有来自mir-17家族簇的mir支架的下部茎区;并且其中

8、-至少一个rna干扰分子具有嵌合支架,其中至少部分的上部茎/环区不是来自与下部茎区相同的mir支架,并且其中所述至少部分的上部茎/环区选自mir-17支架、mir-20a支架、mir-106a支架、mir-20b支架、mir-106b支架和mir-93支架;和/或其中

9、-来自至少两个rna干扰分子的支架是来自不同mir-17家族簇的mir-17家族支架。

10、6.一种适合在工程化免疫细胞中表达的载体,其包含根据项1至5中任一项所述的核酸分子。

11、7.一种工程化细胞,其包含:

12、o编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子,和

13、o包含具有工程化支架的至少一个rna干扰分子的第二核酸分子,其中所述支架的下部茎区是来自mir-17家族簇的mir支架的下部茎区,并且其中支架的至少部分的上部茎/环区已被工程化以不同于野生型/天然序列。

14、8.一种工程化细胞,其包含:

15、o编码感兴趣的蛋白的第一外源本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种核酸分子,其包含具有工程化支架的至少一个RNA干扰分子,其中所述工程化支架包含下部茎区和上部茎/环区,并且其中所述支架的下部茎区是来自miR-17家族簇的miR支架的下部茎区,并且其中所述支架的至少部分的上部茎/环区已被工程化以不同于野生型序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子,其中所述工程化支架的下部茎区选自miR-17支架、miR-18a支架、miR-19a支架、miR-20a支架、miR-19b-1支架、miR-92-1支架、miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架、miR-363支架、miR-106b支架、miR-25支架和miR-93支架。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子,其中所述工程化支架是嵌合支架,并且其中至少部分的所述上部茎/环区不来自与所述下部茎区相同的miR支架,并且其中所述至少部分的所述上部茎/环区选自miR-17支架、miR-20a支架、miR-106a支架、miR-20b支架、miR-106b支架和miR-93支架。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子,其中所述至少一个RNA干扰分子是至少两个多重化RNA干扰分子。

5.一种核酸分子,其包含具有不同支架的至少两个RNA干扰分子,其中至少两个不同支架具有来自miR-17家族簇的miR支架的下部茎区;并且其中

6.一种适合在工程化免疫细胞中表达的载体,其包含根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子。

7.一种工程化细胞,其包含:

8.一种工程化细胞,其包含:

9.根据权利要求7或8所述的工程化细胞,其是工程化免疫细胞。

10.根据权利要求9所述的工程化细胞,其中所述工程化免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、干细胞、祖细胞和iPSC细胞。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的工程化细胞,其中所述感兴趣的蛋白是受体,特别是嵌合抗原受体或TCR。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的工程化细胞,其中所述至少一个RNA干扰分子是在一个启动子控制下的至少两个多重化RNA干扰分子。

13.根据权利要求12所述的工程化细胞,其中所述至少两个多重化RNA干扰分子是至少三个多重化RNA干扰分子。

14.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子、根据权利要求6所述的载体或根据权利要求7至13中任一项所述的工程化细胞,其用作药物。

15.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子、根据权利要求6所述的载体或根据权利要求7至13中任一项所述的工程化细胞,其用于治疗癌症。

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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.一种核酸分子,其包含具有工程化支架的至少一个rna干扰分子,其中所述工程化支架包含下部茎区和上部茎/环区,并且其中所述支架的下部茎区是来自mir-17家族簇的mir支架的下部茎区,并且其中所述支架的至少部分的上部茎/环区已被工程化以不同于野生型序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子,其中所述工程化支架的下部茎区选自mir-17支架、mir-18a支架、mir-19a支架、mir-20a支架、mir-19b-1支架、mir-92-1支架、mir-106a支架、mir-18b支架、mir-20b支架、mir-19b-2支架、mir-92-2支架、mir-363支架、mir-106b支架、mir-25支架和mir-93支架。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子,其中所述工程化支架是嵌合支架,并且其中至少部分的所述上部茎/环区不来自与所述下部茎区相同的mir支架,并且其中所述至少部分的所述上部茎/环区选自mir-17支架、mir-20a支架、mir-106a支架、mir-20b支架、mir-106b支架和mir-93支架。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子,其中所述至少一个rna干扰分子是至少两个多重化rna干扰分子。

5.一种核酸分子,其包含具有不同支架的至少两个rna干扰分子,其中至少两...

【专利技术属性】
技术研发人员:E·布雷曼M·斯特克洛夫M·罗西
申请(专利权)人:塞利亚德肿瘤股份公司
类型:发明
国别省市:

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