【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组细胞、重组细胞的制备方法以及异戊二烯或萜烯的生产方法。本专利技术的重组细胞稳定地保持了通过甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，并且具有高的异戊二烯或萜烯的生产性。
技术介绍
1、异戊二烯是合成聚异戊二烯的单体原料，特别是在轮胎工业中是重要的材料。另一方面，萜烯是以碳原子数为5的异戊二烯作为构成单元的烃，并且是由植物、昆虫、菌类等产生出的一组生物体物质。异戊二烯以及萜烯用于树脂原料、香料原料、食品添加剂、洗涤剂、电子材料、医药和农药原料等的所有领域，并且是作为工业材料必不可少的物质。
2、由于异戊二烯主要作为石脑油或乙烯生产的石油裂解的副产物而通过石化工艺进行生产，因此对于将来的需求而言，原料的可持续性存在危险。此外，由于许多有用的萜烯是从植物或其精油等天然的原料中提取·纯化而得的，因此难以大量获得。虽然也尝试了化学合成，但是具有复杂结构的萜烯的合成需要极大的成本和劳动力。因此，异戊二烯或萜烯的已有的生产方法中存在许多的问题。
3、近年来，在各种物质生产领域中，利用了微生物等并且通过生物技术而向新的生产工艺的转换技术的开发和实用化正在稳步发展。关于异戊二烯或萜烯，例如，已知使用糖作为原料的重组大肠杆菌的生产技术(例如，专利文献1、2)。然而，这些全部被限制为少量的连续生产或通过诱导表达系统的瞬时生产，从未有过可以进行恒定的大规模生产的例子。因此，特别是在该
中，需要能够实现稳定大规模生产的新技术。需要说明的是，作为通过大肠杆菌以外的微生物(重组体)的异戊二烯的生产技术，例如存在专利文
4、就通过微生物(重组体)生产异戊二烯或萜烯而言，在微生物中大量合成构成其前体的异戊烯二磷酸(ipp)和构成其异构体的二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)是必要的。ipp能够通过两种不同的代谢途径合成，即甲羟戊酸途径(mva途径)和非甲羟戊酸途径(mep途径)。甲羟戊酸途径存在于真核细胞的细胞质、一部分的放线菌或古细菌中。非甲羟戊酸途径存在于细菌或植物的叶绿体等中。
5、甲羟戊酸途径(mva途径)使用乙酰coa作为起始材料。作为在甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：乙酰coa乙酰转移酶、hmg-coa合成酶、hmg-coa还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
6、另一方面，非甲羟戊酸途径(mep途径)使用甘油醛3-磷酸和丙酮酸作为起始材料。作为在非甲羟戊酸途径中起作用的酶，从上游起依次可举出：doxp合成酶、doxp还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶、2-c-甲基-d-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、hmb-pp合成酶以及hmb-pp还原酶。
7、在使用大肠杆菌等细菌生产异戊二烯或萜烯时，可以认为，除了内源性mep途径之外，还可以通过导入在能量上占优势的外源mva途径来进行更有效的前体合成。即，由于内源性mep途径受到多重且精密的控制，其改变是非常困难的，难以改变内源性mep途径而实现作为前体的ipp的大规模合成。因此，为了大量获得异戊二烯、萜烯等目标产物，优选利用mva途径进行前体合成能力的提高。
8、然而，当向宿主中导入外源mva途径时，随着通过mva途径的前体合成效率的提高，生物合成途径中的中间代谢物引起的细胞毒性不容忽视。因此，在已导入外源mva途径的宿主中，为了避免这些毒性物质的积蓄，能积极地接受mva途径的基因中发生突变并丧失了功能的基因。其结果，在导入外源mva途径并生长而得的克隆中，丧失mva途径的活性并且依赖于内源性mep途径活性的克隆具有优势。可以认为，这种现象是阻碍获得稳定的高生产异戊二烯或萜烯的菌株的重要因素之一。因此，为了通过微生物而提高异戊二烯、萜烯等目标产物的生产量，有必要获得不依赖于mep途径并且具有通过mva途径的稳定的ipp合成能力的克隆，并且提高通过mva途径的前体合成能力。
9、现有技术文献
10、专利文献
11、[专利文献1]日本特表2011-505841号公报
12、[专利文献2]日本特表2011-518564号公报
13、[专利文献3]国际公开第2014/065271号
14、[专利文献4]国际公开第2014/104202号
技术实现思路
1、专利技术所解决的技术问题
2、为了实现上述目的，例如，期望利用缺失了通过内源性mep途径合成ipp的能力并且仅通过mva途径合成ipp而生长的微生物。然而，具有这种特征(基因型)的生产异戊二烯或萜烯的微生物(重组体)仍是未知的，并且使用了该微生物来生产异戊二烯或萜烯的方法也是未知的。
3、因此，本专利技术的目的是提供能够稳定地大量生产异戊二烯或萜烯的重组细胞，以及使用该重组细胞来生产异戊二烯或萜烯的方法。
4、解决问题的技术手段
5、本专利技术的一个实施方式是一种重组细胞，其能够生产异戊二烯或萜烯，所述重组细胞具有通过甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，其中，选自doxp合成酶、doxp还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶、2-c-甲基-d-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、hmb-pp合成酶以及hmb-pp还原酶中的至少一种内源性酶的活性发生了缺失，从而缺失了通过内源性非甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，上述重组细胞具有编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码二萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因或编码八氢番茄红素合成酶的基因，作为第一外源基因，表达上述第一外源基因，能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜烯。
6、上述甲羟戊酸途径优选是外源性甲羟戊酸途径。
7、通过上述外源性甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力优选是通过下述基因实现的：编码选自乙酰coa乙酰转移酶、hmg-coa合成酶、hmg-coa还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶以及二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的至少一种酶的第二外源基因。
8、上述重组细胞优选是细菌。
9、上述重组细胞优选是古细菌。
10、上述重组细胞，优选能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。
11、上述重组细胞，优选具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及coa来合成乙酰coa的功能。
12、上述重组细胞，优选是梭菌属(clostridium)细菌或穆尔氏菌属(moorella)细菌。
13、上述重组细胞，优选是属于甲烷八叠球菌属(methanosarcina)、甲烷球菌(methanococcus)或甲烷热球菌属(methanothermococc)的古细菌。
14、上述重组细胞，优选能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组细胞，其为能够生产异戊二烯的梭菌属(Clostridium)细菌的重组细胞，所述重组细胞具有第一能力，即通过外源性甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，其中，
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。
3.根据权利要求1所述的重组细胞，其具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA来合成乙酰CoA的功能。
4.根据权利要求1所述的重组细胞，其进一步具有编码异戊烯基二磷酸异构酶的第三外源基因。
5.一种重组细胞的制备方法，其制备权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，所述制备方法包含下述工序：
6.一种异戊二烯的生产方法，其中，
7.根据权利要求6所述的异戊二烯的生产方法，其包含下述工序：
【技术特征摘要】
1.一种重组细胞，其为能够生产异戊二烯的梭菌属(clostridium)细菌的重组细胞，所述重组细胞具有第一能力，即通过外源性甲羟戊酸途径合成异戊烯二磷酸的能力，其中，
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其能够用选自一氧化碳和二氧化碳中的至少一种作为唯一碳源进行增殖。
3.根据权利要求1所述的重组细胞，其具有由甲基四氢叶酸或甲基四氢蝶呤、一氧化...
【专利技术属性】
技术研发人员：松岛加奈，古谷昌弘，川端一史，
申请(专利权)人：积水化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：
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