【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，尤其涉及一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的引物和探针及其检测方法。
技术介绍
1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，单股环状dna，基因组较小,通常为1759-2319nt。目前，将pcv分为4个血清型，分别为pcv1、pcv2、pcv3和pcv4，其中pcv1能感染猪但不具备致病性，pcv3与猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍和心脏及多组织器官炎症有关，pcv4最近才被发现，相关研究较少。pcv2引起猪圆环病毒相关系统性疾病(pcv2system disease，pcv2-sd)，与其他pcv2相关病理性疾病等合称为猪圆环病毒病(pcvds)。pcv2是引起pcvds的主要致病病原体，也是pcv2-sd的主要病原体，呈全球性流行，在五大洲均被发现。pcv2主要感染6-15周龄的断奶仔猪，6-8周仔猪最易感，夏季感染率最高能达到44.0％，春、秋、冬次之，一般死亡率在5％-35％，但是一旦与其他细菌或病原共感染时，死亡率会大大增加，目前猪非典型瘟病毒病毒与pcv2混合感染率较高。
2、猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，appv)，是单股正链rna病毒，黄病毒科瘟病毒属的成员之一，是引起仔猪先天性震颤的主要病原之一，对脊髓造成组织性损伤，呈现四肢及头部不规律震颤的病症，导致仔猪吃不上母乳饥饿而死，且混合感染较普遍。appv呈全球范围流行，2015年首次在美国报道，后在欧洲、美洲、亚洲均有报道。该病毒基因组
3、猪瘟病毒(classical swine fever virus，csfv)同appv相同都属于黄病毒科瘟病毒属，csfv很稳定，但对温度较敏感，病毒粒子在50℃可以存活3天，37℃可以存活1周，在-70℃可以存活多年，但感染性依旧存在，在冻肉中可以存活至少2个月，60℃以上持续60min才能保证完全破坏病毒。ph5-10时较稳定，乙醚、氯仿、去氧胆酸盐能使csfv迅速失去感染性，对蛋白酶敏感，对二甲基亚砜稳定。猪只感染csfv会出现结膜炎和白细胞减少，最典型的症状皮肤和粘膜斑点性出血，中枢神经紊乱，导致小脑发育不全，全身性肌肉震颤，便秘及随后的腹泻都是特征性的临床症状。猪瘟主要是通过直接接触传播，感染猪是最大的传播源，感染猪群的流动造成病毒持续传染。因为猪瘟具有高度接触传染性和巨大的经济破坏力，国际兽疫局将猪瘟划分为a类传染病。
4、目前，现有技术多通过普通pcr，荧光pcr检测单一的检测appv、csfv或pcv2，这样不仅操作麻烦而且所花费的时间和成本也较高。因此，目前急需可以同时检测appv、csfv或pcv2的检测方法，从而有效解决现有技术中存在的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的引物和探针及其检测方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的引物和探针，所述pcv2的引物的上游序列为：5'–ctactgctgtgagtaccttgt-3'；所述pcv2的引物的下游序列为：5'–gtcttccaatcacgcttctgc-3'；
4、所述pcv2的探针为：fam-ccgttgcagagcagcaccctg-bhq1；
5、所述appv的引物的上游序列为：5'-gacgtcaccgagtagtacacc-3'；所述appv的引物的下游序列为：5'-ggtccaccaccgatttc-3'；所述appv的探针为：vic-aggtgtagggtctactgargctc-bhq1；
6、所述csfv的引物的上游序列为：5'-ggagggactagccgtagt-3'；
7、所述csfv的引物的下游序列为：5'-tcgaactactgacgactgtc-3'；所述csfv的探针为：cy5-tcaggacttagaccacccagg-bhq2。
8、优选地，所述pcv2的探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1基团；
9、所述appv的探针的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1基团；
10、所述csfv的探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2基团。
11、其次，本专利技术提供了一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括pcv2的引物和探针，appv的引物和探针以及csfv的引物和探针。
12、优选地，所述试剂盒还包括：2x one step probe mix，one step q probe enzymemix，rnase-free水和模板。
13、优选地，所述试剂盒的20ul反应体系为：10μl 2×one step probe mix，1μlonestep q probe enzyme mix，0.33μl pcv2上游引物，0.33μl pcv2下游引物，0.16μl pcv2探针，0.33μl appv上游引物，0.33μl appv下游引物，0.13μl appv探针，0.33μl csfv上游引物，0.33μl csfv下游引物，0.16μl csfv探针，2.63μl rnase-free水，4μl dna模板。
14、优选地，所述试剂盒的反应条件为55℃5min；95℃30s；95℃10s、60℃30s，40个循环。
15、其次，本专利技术提供了一种用于非疾病诊断的pcv2、appv和csfv的多重taqman荧光定量pcr检测方法，所述检测方法包括如下步骤:
16、(1)使用多重taqman荧光定量pcr试剂盒对pcv2、appv和csfv的标准模板进行荧光定量pcr反应并绘制标准曲线；
17、(2)使用多重taqman荧光定量pcr试剂盒对待测样品进行检测，得到检测结果；
18、(3)当检测结果出现典型的扩增曲线时，认为样品含有pcv2、appv和/或csfv病毒，并通过标准曲线对待测样品进行定量分析；
19、当检测结果未出现典型的扩增曲线时，则认为样品不含有pcv2、appv和/或csfv病毒。
20、本专利技术的有益效果在于：
21、本专利技术所提供的pcv2、appv和csfv的引物和探针能够实现pcv2、appv和csfv的同时检测，且pcv2、appv和csfv最低检测2.26copie本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于同时检测PCV2、APPV和CSFV的引物和探针，其特征在于，所述PCV2的引物的上游序列为：5'–CTACTGCTGTGAGTACCTTGT-3'；所述PCV2的引物的下游序列为：5'–GTCTTCCAATCACGCTTCTGC-3'；
2.根据权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述PCV2的探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1基团；
3.一种用于同时检测PCV2、APPV和CSFV的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCV2的引物和探针，APPV的引物和探针以及CSFV的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2x One Step ProbeMix，One Step Q Probe Enzyme Mix，RNase-free水和模板。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的20ul反应体系为：10μl 2×One Step Probe Mix，1μl One Step Q Probe Enzym
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为55℃5min；95℃30s；95℃10s、60℃30s，40个循环。
7.一种用于非疾病诊断的PCV2、APPV和CSFV的多重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤:
...【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的引物和探针，其特征在于，所述pcv2的引物的上游序列为：5'–ctactgctgtgagtaccttgt-3'；所述pcv2的引物的下游序列为：5'–gtcttccaatcacgcttctgc-3'；
2.根据权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述pcv2的探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1基团；
3.一种用于同时检测pcv2、appv和csfv的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的pcv2的引物和探针，appv的引物和探针以及csfv的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2x one step probemix，one step q probe enzyme mix，rnase-free水和模板。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李孝文，向路，候壮，李洋，乔梦丽，王聪霞，武利利，樊铭玉，
申请(专利权)人：夏津新希望六和农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：
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