【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵，具体涉及一种提高质粒发酵产量的发酵方法及其应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、质粒dna在细胞和基因治疗领域起着关键性作用。近年来，随着生物制品的不断发展，质粒dna在dna疫苗、基因替代载体和病毒包装等方面应用越来越多。因而对大规模高纯度、高质量质粒dna的需求也越来越大。
3、大肠杆菌发酵是目前生产质粒dna主要方式，大肠杆菌的高密度培养能够显著提高菌体发酵密度和产物的比率，但大肠杆菌发酵生产质粒时，质粒特别是大的质粒，会对菌体自身生长造成较大负荷，因此发酵过程菌体的光密度（optical density，od）值很难提高，导致质粒产量不高，导致无法实现工业化大规模高纯度、高质量质粒的生产。因而，如何提高大肠杆菌发酵od值及发酵质粒的产量已成为亟需解决的问题。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种提高质粒发酵产量的发酵方法。本专利技术通过使用不同的补料策略及发酵方式，有效提高菌体生长od600和质粒dna产量。
2、具体地，本专利技术的技术方案如下所述：
3、本专利技术的第一方面，提供一种提高质粒发酵产量的发酵方法，所述方法包括：
4、（1）将冷冻保存的含有目的质粒的菌种常温复苏后接种至培养基中，37℃培养至od60
5、（2）配制发酵培养基、第一补料培养基和第二补料培养基，将发酵培养基加入发酵罐内，将第一补料培养基和第二补料培养基加入补料瓶内；
6、（3）将所述活化后的种子液接种至发酵罐内；
7、（4）设定初始发酵培养条件为：温度37℃、ph7.0，溶氧设定在40%，溶氧偶联转速设定为400~800rpm；压缩空气通气量3 lpm升/分钟，在初始发酵培养条件下发酵至对数生长期后，降低发酵温度继续发酵的同时使用所述第一补料培养基进行间歇补料；发酵至对数生长中后期提高发酵温度、通入氧气的同时将所述第一补料培养基更换为第二补料培养基继续发酵，至发酵菌体od值不再提高后结束发酵。
8、在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述目的质粒为plp1质粒。
9、在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述含有目的质粒的菌种为含有目的质粒的大肠杆菌细胞；优选的，所述大肠杆菌细胞选自dh5α、jm109、stbl3。
10、在一种具体的实施方式中，步骤（2）中所述发酵培养基的组成为：酵母粉24 g/l，胰蛋白胨12 g/l，磷酸二氢钾3.8 g/l，磷酸氢二钾16.38 g/l，磷酸氢二钠6g/l，mgso4.7h2o0.5 g/l，甘油6.3 g/l，硫酸铵6 g/l。
11、所述第一补料培养基（200ml）的组成为：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.45 g。
12、所述第二补料培养基（200ml）的组成为：甘油100 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.34 g。
13、所述葡萄糖母液的组成为：一水葡萄糖55 g，加水定容至100 ml。
14、在一种具体的实施方式中，步骤（3）中发酵罐接种比例为1：10。
15、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中发酵初始补加所述葡萄糖母液至发葡萄糖的浓度达到10 g/l。
16、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述发酵至对数生长期后使用所述第一补料培养基补料，包括：使用所述第一补料培养基补料，其中所述第一补料培养基的用量为10~20 ml。
17、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述降低发酵温度继续发酵，包括：降低发酵温度至32~35℃继续发酵。
18、在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述发酵至对数生长中后期提高发酵温度，包括：发酵至对数生长中后期提高发酵温度至38~40℃。
19、在一种具体的实施方式中，步骤（4）之后还包括：发酵结束后，通过离心收集菌体，将所述菌体-80℃保存。
20、在一种具体的实施方式中，所述发酵菌体od值通过紫外分光光度计进行检测。
21、本专利技术的方法将含有目的质粒的菌种接种活化后培养至一定体积和密度，然后转接至发酵罐内进行发酵培养，培养至指数生长期后开始补料培养，优化发酵过程温度、溶氧参数、补料策略，至发酵菌体od600稳定后终止发酵，收获菌体用于下游纯化。
22、在本专利技术的第二方面，提供一种第一方面所述提高质粒发酵产量的发酵方法在质粒制备中的应用。
23、本专利技术具有以下有益效果：
24、本专利技术提供一种可以显著提高质粒发酵产量的发酵方法。通过优化发酵过程参数，最终发酵菌体od600和质粒dna产量均有显著提升，因此具有良好的实际应用之价值。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高质粒发酵产量的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述目的质粒为pLP1质粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有目的质粒的菌种为含有目的质粒的大肠杆菌细胞；优选的，所述大肠杆菌细胞选自DH5α、JM109、Stbl3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养基的组成为：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸二氢钾3.8 g/L，磷酸氢二钾16.38 g/L，磷酸氢二钠6g/L，MgSO4.7H2O 0.5 g/L，甘油6.3 g/L，硫酸铵6 g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一补料培养基（200mL）的组成为：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.45 g。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第二补料培养基（200mL）的组成为：甘油100 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.34 g。
7.如权利要求1所述的方法
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述降低发酵温度继续发酵，包括：降低发酵温度至32~35℃继续发酵。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述发酵至对数生长中后期提高发酵温度，包括：发酵至对数生长中后期提高发酵温度至38~40℃。
10.权利要求1~9任一项所述的提高质粒发酵产量的发酵方法在质粒制备中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高质粒发酵产量的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述目的质粒为plp1质粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有目的质粒的菌种为含有目的质粒的大肠杆菌细胞；优选的，所述大肠杆菌细胞选自dh5α、jm109、stbl3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养基的组成为：酵母粉24 g/l，胰蛋白胨12 g/l，磷酸二氢钾3.8 g/l，磷酸氢二钾16.38 g/l，磷酸氢二钠6g/l，mgso4.7h2o 0.5 g/l，甘油6.3 g/l，硫酸铵6 g/l。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一补料培养基（200ml）的组成为：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱学良，孙玉桃，李正学，徐文强，董成涛，巩颖颖，
申请(专利权)人：山东丽山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。