【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织工程，尤其涉及一种乳牙牙髓干细胞富集胶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、临床中因龋病、牙结构异常、牙外伤和医源性因素造成的牙髓坏死及根尖周炎疾病发生率较高。对于恒牙来说，目前的临床治疗方法以根管治疗为主，年轻恒牙则多施以根尖诱导成形术。尽管能保存患牙咬合位置并恢复适量的咀嚼功能，但是远期不可避免出现牙齿变色、牙体脆裂、根折等。因此，近年来牙髓再生性治疗是口腔医学领域的攻关热点，而恢复牙髓组织的活性及功能具有重要的临床意义。
2、国内外研究学者纷纷采用乳牙牙髓干细胞、牙髓干细胞、牙囊干细胞、根尖牙乳头干细胞、以及多种非牙源性干细胞如骨髓间充质干细胞等作为种子细胞，复合多种生物支架材料或生长因子，模拟成牙分化的微环境条件，尝试进行了很多全长牙髓再生动物学实验，但大多数再生牙髓组织的形态结构不理想。如nakashima等人利用牙髓干细胞悬液通过注射方式进行牙髓再生治疗，术后6个月临床检查根尖周组织未见异常，但牙髓血运和活力状态没有明显改善。主要原因是牙根髓腔密闭性结构不利于血运重建，细胞数目不足，植入干细胞群落无法获得充分的营养供应，造成局部组织缺血性坏死。
3、课题组原创性地建立了乳牙牙髓干细胞聚合体制备技术，在巴马系小型猪模型上首次实现了全长牙髓再生，再生组织具有与正常牙髓相同的血管、神经以及成牙本质细胞层的组织形态。随后开展了自体乳牙牙髓干细胞聚合体用于年轻恒牙牙髓再生的临床试验研究临床试验，实现了理想的全长牙髓再生，牙髓活力检测阳性，牙髓血流分析接近正常，牙根继续发育，并具有良好的生
4、前期课题组在临床应用时发现，聚集体虽然具有良好的牙髓再生效果，但其存在可塑性较差的弊端，导致临床操作时无法准确将其放入根尖部位置，不仅提升了操作难度，还增加了操作时间。因此本专利技术拟通过应用具有良好组织相容性、可塑性较强的水凝胶载体，利用其良好的可塑性，将其与聚集体在模具中混合制备成锥形、实用性强的富集胶，对富集体精确塑形后精准植入根管部位，极大降低了操作难度，节约了操作时间，并以期进一步提升再生效果。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，将乳牙牙髓组织分离培养出的干细胞诱导形成富集体，并搭配生物凝胶制备可塑形的富集胶；本专利技术的目的是通过下述方案得以实现的：
2、一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、s1：从乳牙牙髓组织中分离培养乳牙牙髓干细胞；
4、s2：将乳牙牙髓干细胞诱导培养，形成乳牙牙髓干细胞富集体；
5、s3：将乳牙牙髓干细胞富集体与生物凝胶混合，制备得到乳牙牙髓干细胞富集胶。
6、进一步的，步骤s1的具体操作包括以下步骤：
7、s11：采用胶原酶消化法进行乳牙牙髓干细胞的原代培养，得到p0代乳牙牙髓干细胞；
8、s12：采用克隆分选方法对p0代乳牙牙髓干细胞进行传代培养，得到p1代乳牙牙髓干细胞；
9、s13：采用胰蛋白酶消化法对p1代乳牙牙髓干细胞进行传代培养，得到p4代乳牙牙髓干细胞。
10、进一步的，步骤s12的具体操作包括以下步骤：
11、s121：进行细胞计数，将p0代乳牙牙髓干细胞悬液根据计数量制备为105个/ml的悬液；
12、s122：利用含10％血清的培养液将105个/ml的悬液稀释至101个/ml，即每0.1ml一个细胞；
13、s123：在96孔板中每孔加入0.1ml细胞悬液，置于37℃、5％二氧化碳培养箱；
14、s124：每3日更换培养液，待第7日时，即得到p1代乳牙牙髓干细胞。
15、进一步的，步骤s13的具体操作包括以下步骤：
16、s131：选择单克隆生长孔，生长良好的p1代乳牙牙髓干细胞，进行消化传代至大皿中扩大培养；
17、s132：重复步骤s131，完成传代培养过程，直到得到p4代乳牙牙髓干细胞。
18、进一步的，步骤s2的具体操作包括以下步骤：
19、s21：取p4代乳牙牙髓干细胞，以105个/孔的细胞密度接种于六孔板中；
20、s22：细胞长到80％时，用包含有0.292mg/ml谷氨酰胺、10～20mm的β-磷酸甘油钠、50～100μg/ml维生素e的α-mem培养基诱导7-14天；
21、s23：每隔48h更换培养液，直到在培养板底部有乳白色、膜片状的乳牙牙髓干细胞富集体形成。
22、进一步的，步骤s3的具体操作包括以下步骤：
23、s31：用pbs清洗乳牙牙髓干细胞富集体，并去除上清；
24、s32：将2～3个乳牙牙髓干细胞富集体取出，吸干水分之后，与温控藻酸盐生物凝胶按照100：1的比例在4℃条件下混合；
25、s33：将混合物置于特定的模具内，并放置于37℃下，形成固体样结构，即为乳牙牙髓干细胞富集胶。
26、利用上述的乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法制备得到的乳牙牙髓干细胞富集胶。
27、上述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶作为牙髓再生根充材料的应用。
28、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
29、1.乳牙牙髓干细胞富集胶具有极佳的可塑型，在模具中可将其定型为特定形状并且具有一定的强度，以便在临床中更为方便的将其输送至根管中；
30、2.乳牙牙髓干细胞富集胶在植入根管后能再生出富含血管的类牙髓样组织，通过招募宿主内皮细胞定植，并促进自身细胞增殖分化，提升再生牙髓中的血运重建效果；
31、3.本专利技术的乳牙牙髓干细胞富集胶包含大量细胞外基质成分，为牙髓再生提供了更适宜的微环境，并具有更好的组织相容性和促牙髓再生作用。
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1.一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体操作包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤S12的具体操作包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤S13的具体操作包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体操作包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤S3的具体操作包括以下步骤：
7.利用权利要求1-6任一项所述的乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法制备得到的乳牙牙髓干细胞富集胶。
8.如权利要求7所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶作为牙髓再生根充材料的应用。
【技术特征摘要】
1.一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤s1的具体操作包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤s12的具体操作包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种乳牙牙髓干细胞富集胶的制备方法，其特征在于，步骤s13的具体操作包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓贺，冯元，
申请(专利权)人：盖柯北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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