【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及阿尔茨海默病领域，尤其涉及一种结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体及其制备方法及应用。
技术介绍
1、β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ)是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein，app)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽。人体内aβ最常见的亚型是aβ1～40和aβ1～42。阿尔茨海默病(ad)又称老年痴呆症，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。尽管ad的发病机制目前尚不明确，但在已有的研究报道中发现，阿尔茨海默病患者的大脑中含有大量被称为斑块的aβ，其错误折叠引起蛋白质功能改变及神经元细胞毒性，从而形成老年斑沉积于脑内和导致触突功能异常而发病，是导致阿尔茨海默病的重要因素。基于此，aβ成为ad的特异性生物标志物之一，人体血液、脑脊液和脑组织内的aβ水平异常与ad的病程进展密切相关，因此对aβ的分析评估对ad早期发现、跟踪、预防和治疗具有重要意义。
2、目前临床上aβ的常规检测方法主要有神经成像方法、光学检测方法及免疫检测方法等，核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景，目前上未有利用核酸适配
技术实现思路
1、本专利技术针对上述问题，提出了一种结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体及其制备方法及应用。
2、本专利技术采取的技术方案如下：
3、一种结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体，包括如下序列，ttcagcactccacgcatagccacggtaaatcactgctgccttgtccctctggtcctcctatgcgtgctaccgtgaa。
4、本种核酸适配体可以结合β-淀粉样蛋白，当本种核酸适配体跟β-淀粉样蛋白结合之后可以被检测到。对于本种核酸适配体与β-淀粉样蛋白结合后的检测，可以将β-淀粉样蛋白固定在表面等离子共振仪(spr)的芯片上，加入本种核酸适配体后，通过仪器信号值的增强对β-淀粉样蛋白进行检测。也可以将β-淀粉样蛋白固定在酶联免疫吸附(elisa)所使用的96孔板上，加入本种核酸适配体后，通过目视颜色的变化以及仪器测定吸光度信号的变化表明两者的结合并对β-淀粉样蛋白进行检测。
5、一种制备如上所述结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体的方法，包括以下步骤，
6、磁珠固定aβ和his步骤
7、aβ偶联：取羧基磁珠用水洗后加入edc和nhs混合液，而后孵育，结束后磁分离去除上清，水洗后加入aβ蛋白和ph 4.5的naac混合，室温孵育40min。孵育结束后磁分离用dpbs洗一次，并加入ph 8.5的乙醇胺，封闭15min；封闭结束后磁分离，用dpbs洗后dpbs定容，存储备用；
8、his偶联：取羧基磁珠用水洗后加入edc和nhs混合液，而后孵育，结束后磁分离去除上清，水洗，加入his蛋白和ph 4.0的naac混合，室温孵育40min，磁分离用dpbs洗，并加入ph 8.5的乙醇胺，封闭15min，磁分离，用dpbs洗后用dpbs定容，存储备用；
9、文库变复性步骤
10、取随机单链核苷酸文库进行离心，将文库离心到管底，用dpbs缓冲液溶解，分装到pcr管进行变复性处理，所述单链核苷酸文库的序列为5’-ttcagcactccacgcatagc(36n)cctatgcgtgctaccgtgaa-3’，其中，“36n”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列；
11、反筛步骤
12、文库变复性后首先与偶联好his的羧基磁珠混合，而后孵育，孵育结束后于磁力架上进行磁吸，收集上清，记作正筛文库，磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool 1-，pool2-，pool 3-，pool 4-，磁珠加dpbs沸水浴，而后收集上清记作elution-；
13、正筛步骤
14、将反筛步骤中得到的正筛文库与偶联好aβ的羧基磁珠混合孵育孵育结束后进行磁吸，去除上清，磁珠用dpbs洗四次，清洗溶液记作pool1+，pool 2+，pool 3+，pool 4+，磁珠加dpbs沸水浴，收集上清记作elution+；
15、e-pcr扩增步骤
16、将e-pcr mix与正筛步骤中获得的elution+混合，轻摇离心管充分混匀而后进行涡旋，将涡旋后的乳浊液平均分装到pcr管中，进行pcr扩增，所述e-pcr mix包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dntp mix、正向引物lib13-s1-fam、反向引物lib13-a2-ploya以及pfu酶，lib13-s1-fam的序列为fam-ttcagcactccacgcatagc，lib13-a2-ploya的序列为aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-spacer18-ttcacggtagcacgcatagg；
17、扩增产物回收步骤
18、收集e-pcr扩增后的产物再用超纯水以及正丁醇进行回收，得到浓缩的e-pcr扩增产物；
19、单链制备步骤
20、将浓缩得到的e-pcr扩增产物加入tbe/尿素变性缓冲液，煮沸变性而后冰浴，而后进行凝胶电泳，使加长的fam标记的链与反向的链分开，而后检测带有fam标记的ssdna，将带有fam标记的ssdna的胶条粉碎提纯，而后再透析得到目标单链。
21、上述过程中是为了富集文库产物。
22、可选的，还包括q-pcr步骤，进行完整筛步骤之后先进行q-pcr步骤而后再进行e-pcr步骤，所述e-pcr步骤包括将pool 1-，pool2-，pool3-，pool4-，elution-，pool 1+，pool2+，pool3+，pool4+以及elution+加入q-pcr mix中进行pcr扩增，所述q-pcr mix中包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dntp mix、正向引物lib13-s1、反向引物lib13-a2、pfu酶以及evagreen；所述lib13-s1的序列为ttcagcactccacgcatagc，所述lib13-a2的序列为ttcacggtagcacgcatagg。
23、q-pcr步骤是为了看筛选过程中文库的富集程度，取完样后剩余的样品进行扩增得到下一轮文库。
24、可选的，所述每100ulq-pcr mix包括双蒸水q-pcr mix中包括双蒸水826μl、10*pfu酶buffer100μl、dntp m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体，其特征在于，包括如下序列，TTCAGCACTCCACGCATAGCCACGGTAAATCACTGCTGCCTTGTCCC TCTGGTCCTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
2.一种制备如权利要求1所述结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体的方法，其特征在于，包括以下步骤，
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括Q-PCR步骤，进行完整筛步骤之后先进行Q-PCR步骤而后再进行e-PCR步骤，所述e-PCR步骤包括将pool 1-，pool2-，pool3-，pool4-，Elution-，pool 1+，pool2+，pool3+，pool4+以及Elution+加入Q-PCR mix中进行PCR扩增，所述Q-PCR mix中包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dNTP mix、正向引物Lib13-S1、反向引物Lib13-A2、Pfu酶以及EvaGreen；所述Lib13-S1的序列为TTCAGCACTCCACGCATAGC，所述Lib13-A2的序列为TTCACGGTAGCACGCATAGG。<...
【技术特征摘要】
1.一种结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体，其特征在于，包括如下序列，ttcagcactccacgcatagccacggtaaatcactgctgccttgtccc tctggtcctcctatgcgtgctaccgtgaa。
2.一种制备如权利要求1所述结合β-淀粉样蛋白的核酸适配体的方法，其特征在于，包括以下步骤，
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括q-pcr步骤，进行完整筛步骤之后先进行q-pcr步骤而后再进行e-pcr步骤，所述e-pcr步骤包括将pool 1-，pool2-，pool3-，pool4-，elution-，pool 1+，pool2+，pool3+，pool4+以及elution+加入q-pcr mix中进行pcr扩增，所述q-pcr mix中包括双蒸水、10*pfu酶buffer、dntp mix、正向引物lib13-s1、反向引物lib13-a2、pfu酶以及evagreen；所述lib13-s1的序列为ttcagcactccacgcatagc，所述lib13-a2的序列为ttcacggtagcacgcatagg。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述每1000ulq-pcr mix包括双蒸水q-pcr mix中包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：高强，牛成镇，吴超超，杨通，
申请(专利权)人：杭州佰辰医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。