【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的il-2衍生物及其应用。
技术介绍
1、白介素-2(il-2，interleukin-2)于1976年被发现，当时被称为t细胞生长因子(t-cell growth factor，tcgf)，是一种在维持t淋巴细胞和nk细胞的正常功能中起着重要作用的球状糖蛋白。天然il-2是一个具有133个氨基酸残基组成的多肽(seq id no：1)，分子量大约15kd。il-2有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位，其中第125位的半胱氨酸不与其它半胱氨酸形成二硫键，故在重组表达时通常突变为其它氨基酸，例如ala或ser等。翻译后修饰包括第3位的苏氨酸糖基化，第58位和105位半胱氨酸残基形成二硫键，并形成其功能必不可少的主要由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成的高级结构(bazan等，science 257,410-413(1992))。il-2主要由活化的t细胞生成，它能促进t细胞的增殖和分化，维持t细胞活性；刺激天然杀伤(nk)细胞的生成、增殖和活化，并诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的生成以及诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞(lak)及肿瘤浸润淋巴细胞；促进t细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进b细胞的增殖(waldmann等,nat rev immunol,595-601(2009))等，这些细胞都有直接或间接有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用，因此il-2有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛的临床应用潜力。il-2通过结合il-2受体(il-2recep
2、另外，野生型il-2本身的半衰期较短，在体内很快会被代谢或者清除，如何延长il-2的半衰期也是il-2分子改造的方向之一。目前在研的il-2中，nektar therapeutics公司开发的nktr-214是进展比较快的分子,它在il-2与cd25结合的界面附近平均偶联了6个peg链。这种peg修饰方式有效地阻断了它与高亲和力il-2r受体的结合，让nktr-214更倾向于激活cd8阳性记忆t细胞和nk细胞。赛诺菲公司的sar444245则通过在il-2蛋白与cd25结合的界面上引入非天然氨基酸，将peg链精准连接在il-2表面，阻断il-2与cd25的结合。然而，尽管众多制药公司或科研机构对il-2分子做了大量的改造与设计，目前在研的il-2类药物仍然存在着毒性较强和活性不高的问题，例如nektar therapeutics公司开发的nktr-214在临床iii期实验中，给药剂量为50μg/kg，仅略高于野生型il-2的35μg/kg的给药剂量，表明其毒性仍然较强，后期临床结果分析也发现nktr-214的临床治疗表现也不尽如意。同时，野生型il-2在中性水溶液中水溶性很低，商业化生产时通常需要引入诸如乙腈等有机溶剂和sds(十二烷基硫酸钠)等有毒物质，这些都限制了il-2的规模化制备和药物制剂开发。
3、因此，现有技术缺乏能够同时对cd25的结合活性进行差别化调节、亲水性高、低毒性、循环半衰期长的il-2突变体或衍生物衍生物。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种il-2衍生物，在保留原有il-2良好的活性下，通过在野生型il-2中引入特定位点的突变、在第125位引入一个突变和在末端融合一段亲水短肽，降低其疏水性，增强亲水特性，使il-2在生产过程中全程使用水相纯化，减少环境污染，降低成本，增加蛋白稳定性；同时通过在另外一个位点上进行不同氨基酸的突变，可以调节il-2同cd25的结合活性，进而得到最优的cd25结合强度；进一步的改造，通过在末端融合的亲水短肽中引入一个半胱氨酸突变，进行peg修饰后延长其半衰期。peg修饰后的分子，在动物实验中表现出较低的毒性和良好的抗肿瘤活性。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
3、在第一方面，本专利技术提供一种il-2突变体或衍生物，所述il-2突变体或衍生物相对于野生型il-2的氨基酸序列seq id no：1的第19位leu发生第一氨基酸突变、第65位pro发生第二氨基酸突变、第125位cys被ala取代，并在c末端引入一条酸性的亲水多肽ist。
4、在优选的实施方式中，所述第一氨基酸突变选自下组的氨基酸取代l19a或l19h。
5、在优选的实施方式中，所述第二氨基酸突变选自下组的氨基酸取代：p65a、p65t、p65s、p65e或p65q。
6、在优选的实施方式中，所述亲水多肽ist的氨基酸序列如seq id no:2所示，具体为sepatsgsetpgsepatsgsetpg。
7、在优选的实施方式中，所述il-2突变体或衍生物的氨基酸序列如seq id no：11-15任一项所示。
8、在第二方面，本专利技术提供一种il-2衍生物，所述il-2衍生物在第一方面所述的il-2突变体或衍生物的c末端亲水多肽ist发生第四氨基酸突变，与ist的氨基酸序列seq idno:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：g19c、g12c或g7c(编号从seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种IL-2突变体或衍生物，其特征在于，所述IL-2突变体或衍生物相对于野生型IL-2的氨基酸序列SEQ ID NO：1的第19位Leu发生第一氨基酸突变、第65位Pro发生第二氨基酸突变、第125位Cys被Ala取代，并在C末端引入一条酸性的亲水多肽IST；
2.一种IL-2衍生物，其特征在于，所述IL-2衍生物在权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：G19C、G12C或G7C，所述氨基酸编号从SEQ ID NO：2中第一个氨基酸开始；其中所述IL-2衍生物还具有连接至C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸的聚乙二醇部分，其中所述聚乙二醇部分具有10～40kDa之间的分子量；
3.一种增加权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的循环半衰期的方法，所述方法包括：(1)在权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物的C末端亲水多肽IST发生第四氨基酸突变，与IST的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，所述第四氨基酸突变选自
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或权利要求2所述任一项IL-2突变体或衍生物的氨基酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或权利要求2所述的IL-2突变体或衍生物与药学上可接受的辅料。
8.权利要求1所述的IL-2突变体或衍生物、权利要求2所述的IL-2衍生物或权利要求7所述的药物组合物在制备应用IL-2作免疫治疗的疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病是癌症、免疫疾病、人类免疫缺陷病毒HIV感染、丙型肝炎病毒HCV感染、风湿性关节炎，特应性皮炎或系统性红斑狼疮。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症是通过刺激免疫系统或通过增殖免疫细胞来治疗的癌症。
...【技术特征摘要】
1.一种il-2突变体或衍生物，其特征在于，所述il-2突变体或衍生物相对于野生型il-2的氨基酸序列seq id no：1的第19位leu发生第一氨基酸突变、第65位pro发生第二氨基酸突变、第125位cys被ala取代，并在c末端引入一条酸性的亲水多肽ist；
2.一种il-2衍生物，其特征在于，所述il-2衍生物在权利要求1所述的il-2突变体或衍生物的c末端亲水多肽ist发生第四氨基酸突变，与ist的氨基酸序列seq id no:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：g19c、g12c或g7c，所述氨基酸编号从seq id no：2中第一个氨基酸开始；其中所述il-2衍生物还具有连接至c末端亲水多肽ist发生第四氨基酸突变的位点的半胱氨酸的聚乙二醇部分，其中所述聚乙二醇部分具有10～40kda之间的分子量；
3.一种增加权利要求1所述的il-2突变体或衍生物的循环半衰期的方法，所述方法包括：(1)在权利要求1所述的il-2突变体或衍生物的c末端亲水多肽ist发生第四氨基酸突变，与ist的氨基酸序列seq id no:2相比，所述第四氨基酸突变选自以下取代：g19c、g12c或g7c；(...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄英姿，高翔，张建军，刘懿，王礼翠，朱笑婷，赵艳宇，张天赋，周家杰，张琪，张秋磊，王雅媛，张维，
申请(专利权)人：北京志道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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