一种以Ａｘｌ为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有Ａｘｌ单克隆抗体的多孔板、生物素标记的Ａｘｌ单克隆抗体（Ｂｉｏｔｉｎ－ＡｘｌＡｂ）检测液、与生物素标记的Ａｘｌ单克隆抗体结合的亲和素－辣根过氧化物酶、显色底物３′，３′，５，５′－四甲基联苯胺和Ａｘｌ蛋白标准品。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤：（１）制备包被有Ａｘｌ单克隆抗体的多孔板；（２）制备生物素标记的Ａｘｌ单克隆抗体（Ｂｉｏｔｉｎ－ＡｘｌＡｂ）检测液；（３）配备亲和素－辣根过氧化物酶、显色底物３′，３′，５，５′－四甲基联苯胺和Ａｘｌ蛋白标准品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医用试剂盒领域，特别涉及一种用于检测妊娠期妇女胎膜早破(PrematureRupture of Fetal Membrane，简称PROM)的夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其 制备方法。
技术介绍
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane，简称ROM)可能在孕期随时发生，在临产 前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周)PROM发生率约为10%;足月前 (37孕周前)PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要 因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在 延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的 管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注 入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标准 检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患 者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物PH值变为偏碱性(正常阴道分泌物pH为4. 5 5. 5)、 显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准确性、 敏感性均较低。Axl受体酪氨酸激酶(Axl receptor tyrosine kinase，说明书的下文中简称为 “Axl”)属于Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族，其配体为Gas6和Protein S。它们广泛表达于 哺乳动物的神经、免疫、生殖、造血和血管等组织中，在神经发育、免疫调节、精子发生、NK细 胞分化、血小板功能以及血管发生中发挥着重要的作用。研究发现Axl和Gas6的表达与胃 肠道肿瘤、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关。Axl与妊娠的关系目前未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以Axl为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其制备 方法，以提高胎膜早破检测的准确性，减轻患者的痛苦。本专利申请的专利技术人通过实验发现Axl是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质 之一，含量为15.28±4.90ng/mL。胎膜早破时将有羊水从羊膜腔中渗漏至阴道，羊水中的 Axl则会出现在阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid，CVF)中。蛋白芯片筛 选实验发现确诊的PROM产妇与确诊的非PROM产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周龄匹 配，无基础疾病，无妊娠合并症)，阴道分泌物/宫颈黏液样本中Axl的浓度具有明显差异。 因此，可将Axl作为胎膜早破的检测指标。本专利技术所述以Axl为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有Axl单克隆 抗体的多孔板、生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)检测液、与生物素标记的 Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3 ‘ ,3'，5，5'-四甲基联苯胺和Axl蛋白标准品。 实验表明，上述试剂盒所含包被有Axl单克隆抗体的多孔板，优选每孔包被Axl单 克隆抗体0. 9yg lyg。上述试剂盒中，所述生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)检测液主要由 生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成， 生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)的浓度为24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度为 1. 5g 3g/100ml，甘油的浓度为 50ml/100ml。所述生物素标记的Axl单克隆抗体(BiOtin-AxlAb)由生物素酰-N羟基丁二酰亚 胺酯和Axl单克隆抗体耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与Axl单克隆抗体的质量比为 0. 5 1 7。为了方便用户使用，本专利技术所述试剂盒还可配备样本稀释液，所述样本稀释液是 在浓度0. Olmol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0. Olmol/L 0. 02mol/L的 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋 白的浓度为Ig 2g/100ml。本专利技术所述以Axl为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，工艺步骤如 下(1)制备包被有Axl单克隆抗体的多孔板用pH = 8 10的碳酸盐缓冲液将Axl单克隆抗体稀释为浓度10 μ g/ml的稀释 液，然后将所述Axl单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4°C包被至少12小时；包被 时间届满后，将浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C进行 封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH = 7. 2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔 板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有Axl单克隆抗体的多孔板，其保存温度 为4V ；(2)制备生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)检测液①以N，N- 二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度 为50 μ g/ μ 1的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以PH = 9. 6的碳酸盐缓冲液为溶剂，Axl单 克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的Axl单克隆抗体溶液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺 酯溶液和所述Axl单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获得生物 素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)；反应结束后，将含生物素标记的Axl单克隆抗 体(Biotin-AxlAb)的反应液装入透析袋中，用pH = 9. 2的磷酸盐缓冲液在4°C进行透析， 透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛 血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g 6g/100ml为限；②将步骤①制备的含生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)和牛血清白 蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1 1计量，在室温下混合均勻即形成生物素标记的 Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)检测液，其保存温度为_20°C ；(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基联苯胺和 Axl蛋白标准品。所述亲和素-辣根过氧化物酶、3'，3' ,5,5'-四甲基联苯胺和Axl蛋 白标准品均为市售商品，可直接从市场购买。本专利技术所述方法中，制备包被有Axl单克隆抗体的多孔板时，所述Axl单克隆抗体稀释液的加入量优选ΙΟΟμ 1/孔，所述浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入量为 120 μ 1/ 孔。本专利技术所述方法中，制备生物素标记的Axl单克隆抗体(Biotin-AxlAb)时，优选 按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与Axl单克隆抗体的质量比=0.5 1 7量取所述酰-N羟基 丁二酰亚胺酯溶液和所述Axl单克隆抗体溶液形成混合液。为方便用户，本专利技术所述方法还配备了样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度 0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羟甲 基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以Ａｘｌ受体酪氨酸激酶为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括包被有Ａｘｌ单克隆抗体的多孔板、生物素标记的Ａｘｌ单克隆抗体检测液、与生物素标记的Ａｘｌ单克隆抗体结合的亲和素－辣根过氧化物酶、显色底物３′，３′，５，５′－四甲基联苯胺和Ａｘｌ蛋白标准品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡怀忠，关祥乾，向洪发，周容，
申请(专利权)人：成都创宜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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