【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物治疗领域，具体涉及一种gsk-3β抑制剂的制备方法。
技术介绍
1、糖原合成酶激酶-3β（gsk-3β）是一种在哺乳动物体内广泛存在的具有严格进化保守性的丝氨酸/苏氨酸激酶，能够参与包括糖代谢、细胞信号、细胞增殖、细胞分化、细胞周期、胚胎发育、细胞凋亡、胰岛素应答以及多种组织器官调节因子在内的多种生理过程，并且在癌症、糖尿病、阿尔兹海默症和炎症等多种病理过程中发挥关键作用。
2、在dna损伤、缺氧等多种情况下，gsk-3β能够诱发细胞凋亡，然而对于肿瘤而言gsk-3β的作用是多重的。例如，gsk-3β在卵巢癌、前列腺癌等癌症病理过程中可以通过抑制性激素受体发挥抑制癌细胞增长的作用；而gsk-3β同样能够促进胰腺癌细胞、结肠癌细胞的存活，起到促进疾病进程的作用。因此，科研工作者们正在对以gsk-3β为靶点的疾病通路展开深入的研究工作，以期在多种疾病的治疗领域带来突破。
3、cp21r7是目前实验室中应用最为广泛的gsk-3β抑制剂之一，广泛应用于gsk-3β或pkc等通路相关领域的研究工作之中。同时，cp21r7还能诱导激活wnt信号通路，可用作干细胞激活剂，诱导干细胞分化。cp21r7对gsk-3β具有很强的选择性抑制作用，ic50约为1.8nm。与已经开发的许多可逆抑制剂相比，gsk-3β的共价抑制剂显著缺乏，因此cp21r7的作用便更加凸显。
4、目前主要通过化学合成制备cp21r7，具体反应路线如下：
5、
6、但是上述cp21r7的反应路线存在
技术实现思路
1、专利技术目的：针对上述的合成cp21r7的现有技术存在的合成产率不高、存在化学污染和残留等问题，本专利技术公开了一种gsk-3β抑制剂的制备方法。
2、本专利技术改造了放线菌chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶，得到了一种关键合成酶cv1218，并利用pmlaad蛋白和marc蛋白与关键合成酶合作制备cp21r7，以解决目前cp21r7制备方法中存在的合成产率不高、存在化学污染和残留等问题。
3、技术方案：一种gsk-3β抑制剂的制备方法，步骤如下：
4、步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建
5、（11）对放线菌chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶cv1218，关键合成酶cv1218的氨基酸序列如seq id no.1所示；
6、（12）利用gibson拼接克隆技术，将关键合成酶cv1218的基因片段克隆到载体pmcsg10中得到表达载体pmcsg10-cv1218，将基因片段pmlaad克隆到载体pet28a(+)中得到表达载体pet28a(+)-pmlaad，将基因片段marc克隆到载体pet26b中得到表达载体pet26b-marc，其中：
7、基因片段pmlaad的氨基酸序列如seq id no.2所示；
8、基因片段marc的氨基酸序列如seq id no.3所示；
9、（13）将构建好的表达载体pet28a(+)-pmlaad、表达载体pmcsg10-cv1218、表达载体pet26b-marc分别转化到感受态细胞bl21(de3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
10、步骤二、关键合成酶的表达
11、（21）制备pmlaad蛋白粗制裂解液；
12、（22）制备cv1218蛋白粗制裂解液；
13、（23）制备marc蛋白粗制裂解液；
14、步骤三、酶促反应体系的搭建
15、（31）向反应容器中依次加入下列物质：
16、
17、（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
18、（33）分别向反应容器中加入600ml marc蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mm，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
19、步骤四、产物的分离
20、将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到gsk-3β抑制剂。
21、进一步地，步骤（21）的具体步骤如下：
22、（211）取10μl的pet28a(+)-pmlaad菌种溶液，加入到5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pet28a(+)-pmlaad种子液，其中：
23、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；
24、（212）将步骤（211）得到的pet28a(+)-pmlaad种子液全部加入到含1l的lb液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含pmlaad表达载体的菌液浓度od600=1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
25、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；
26、（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的iptg，使得iptg在菌液中的浓度为0.1mm，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
27、（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddh2o清洗，随后加入30ml上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
28、所述上样缓冲液的ph值为8.0；
29、所述上样缓冲液包括：100mm tris-hcl、300mm nacl、5mm咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
30、（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
31、变幅杆直径为6mm；
32、破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
33、（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到pmlaad蛋白粗制裂解液。
34、进一步地，步骤（22）的具体步骤如下：
35、（221）取10μl的pmcsg10-cv1218菌种溶液，加入到5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pet26b-cv1218种子液，其中：
36、lb液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/ml；
37、（222）将步骤（221）得到的pmcsg10-cv1218种子液加入到含1l的lb液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、20本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
2.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（21）的具体步骤如下：
3.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（22）的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（23）的具体步骤如下：
5.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
6.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的后处理的具体步骤如下：
【技术特征摘要】
1.一种gsk-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
2.如权利要求1所述的一种gsk-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（21）的具体步骤如下：
3.如权利要求1所述的一种gsk-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（22）的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述的一种gsk-3β抑制剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟雨晴，李岩，王继刚，朱永平，刘艳青，张珺哲，谷丽维，马昂，张昕炜，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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