本发明专利技术涉及一种结合物的制备方法，包括将氨基－氧基同官能的或杂官能的试剂与选自多糖、寡糖、碳水化合物和包含至少一个羰基的含碳水化合物分子的实体反应，生成经至少一个肟键官能化了的多糖、寡糖、碳水化合物或含碳水化合物分子。然后经官能化的化合物直接或者间接地与蛋白质部分反应生成可以用作疫苗的蛋白质－碳水化合物结合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求美国临时申请Nos.60/539,573(申请日为2004年1月29日)，和美国临时申请Nos.60/589,019(申请日为2004年7月20日)的优先权利益。
技术介绍
本专利技术涉及一种共价连接蛋白质和多糖生成结合疫苗的方法，该方法包括一个含羰基的基团与氨基-氧基官能团(amino-oxy functional groups)的反应。在疫苗接种方法中，医学上利用身体的先天能力通过抗原免疫使自身防御侵害，所述抗原不会引起疾病但可刺激抗体生成以防御疾病。例如，注射死亡的有机体以防御细菌类疾病如伤寒和百日咳，注射类毒素防御破伤风和白喉，和注射减毒的有机体防御病毒类疾病如脊髓灰质炎和麻疹。然而，仅仅通过注射这种外源药剂并不能够始终刺激抗体生成。也就是说，疫苗制剂必须是免疫原性的，能够诱发免疫应答。某些制剂如破伤风类毒素可自然引发免疫应答，无需修饰就可以疫苗形式施用。然而其它一些重要的药剂是非免疫原性的，必须将其转变为免疫原性的分子或结构才能诱发免疫应答。免疫应答是复杂的系列反应，通常可描述为(1)抗原进入身体并且遇到抗原呈递细胞，抗原呈递细胞可处理抗原并将抗原片段保持在其表面；(2)T细胞识别保持在抗原呈递细胞表面的抗原片段并协助其到达B细胞；和(3)B细胞被刺激后增殖并分化成可分泌抗体抵御抗原的抗体生成细胞。大多数抗原仅在T细胞协助下产生抗体，因此称为T细胞依赖性(TD)。这样的T细胞依赖性抗原的实例是破伤风和白喉类毒素。一些抗原，如多糖，不能被抗原呈递细胞正确处理并被T细胞识别。这些抗原不需T细胞辅助诱发抗体生成，但能直接活化B细胞，因此被称为非T细胞依赖性抗原(TI)。这种非T细胞依赖性抗原包括b型流感嗜血菌(H.influenza)磷酸多核糖基核糖醇(PRP)(polyribosyl-ribitol-phosphate)和肺炎球菌的荚膜多糖。非T细胞依赖性与T细胞依赖性抗原还存在其它的差别。A)T细胞依赖性抗原能预备免疫应答以致对同一抗原的二次激发产生记忆应答，而非T细胞依赖性抗原则不能。B)用T细胞依赖性抗原接种后，抗体与抗原的亲合力随时间增加，而非T细胞依赖性抗原则不能。C)T细胞依赖性抗原能比非T细胞依赖性抗原更有效地刺激未成熟的或新生的免疫系统。D)T细胞依赖性抗原通常刺激产生IgM，IgG1，IgG2a和IgE抗体，而非T细胞依赖性抗原刺激产生IgM，IgG1，IgG2b，和IgG3抗体。T细胞依赖性抗原能刺激产生一级和二级应答，其在成熟的和新生的免疫系统中都是长寿命的，但是必须频繁地与佐剂(增强免疫应答的物质)一起给药。很小的蛋白质，如肽，即使与佐剂一起给药时，也很少是免疫原性的。非T细胞依赖性抗原，如多糖，在缺少佐剂的情况下能够刺激产生免疫应答，但是不能刺激产生高水平的或延长的抗体反应。它们也不能刺激未成熟的或B细胞缺陷的免疫系统(Mond，J.J.Immunological Reviews，6499(1982)；Mosier，D.E.等人，J.Immunol.，1191874(1977))。人们期望为儿童提供针对非T细胞依赖性抗原的保护性免疫，特别是针对来自于生物体流感嗜血菌、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningiditis)的荚膜多糖。增强非T细胞依赖性抗原免疫应答的一个途径涉及将多糖如流感嗜血菌PRP(Cruse，J.M.，Lewis，R.E.Jr.，eds.，Conjugate Vaccines inContributions to Microbiology and Immunology，Vol.10，1989))，或寡糖抗原(Anderson，P.W.等人，J.Immunol.1422464，(1989))结合到T细胞依赖性抗原如破伤风或白喉类毒素上。这种途径下T细胞辅助的增多显示为对经免疫的婴儿赋予增强的免疫力。对于不能对多糖单独产生应答的婴儿，蛋白质-多糖结合疫苗刺激其产生了抗多糖抗体应答。蛋白质和多糖结合可产生其它有益的结果。例如申请人已经发现蛋白质/多糖结合物不仅可增强对多糖组分的抗体应答，而且可增强对蛋白质组分的抗体应答。该效果，例如，在美国专利No.5,955,079中有描述。这些效果在A.Lees，等人，Vaccine，12(13)1160(1994)中也有描述。技术的发展使蛋白质与多糖容易结合。参见，例如，Dick，W.E.等人，″Glyconjugates of Bacterial Carbohydrate AntigensA Survey andConsideration of Design and Preparation Factors，″Conjugate Vaccines(Eds.Cruse，等人)，p.48(1989)。然而由于活化剂或官能试剂在水中不稳定，许多碳水化合物的活化技术不适于在水介质中使用。例如，在Marburg等的美国专利No.4,695,624中描述的N，N′-羰二咪唑，必须在有机介质中使用。同官能的或异官能的乙烯砜(vinylsulfone)试剂已经被用于活化多糖。经活化的多糖在适当的反应条件下与蛋白质、肽、或半抗原反应，产生结合物。这些更详细地描述在美国专利No.6,309,646中。产生结合疫苗的另一种方法包括将脲阳离子盐试剂与可溶的第一部分如多糖或碳水化合物混合，并且随即与第二部分如蛋白质、肽、或碳水化合物结合，产生结合疫苗。该方法描述在美国专利No.6,299,881中。多数碳水化合物在结合之前必须活化，并且溴化氰(CNBr)是常选的活化剂。参见，例如，Chu et al.，Inf.& Imm.，40245(1983)。第一个被许可的结合疫苗是用CNBr活化HIB PRP，然后用己二酸二酰肼衍生并用水溶性的碳二亚胺将其与破伤风类毒素结合而制备的。1-氰基-4-(二甲氨基)-吡啶四氟硼酸盐，也称″CDAP″，已被描述用在水介质中活化多糖。这些活化多糖可直接或间接地与蛋白质结合。CDAP的使用描述在，例如，美国专利No.5,849,301中和Lees，等人，″Activation of SolublePolysaccharides with 1-Cyano-4-Dimethylamino Pyridinium TetrafluoroborateFor Use in Protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines and ImmunologicalReagents，″Vaccine，14(3)190(1996)。简要地概述CNBr-活化方法，CNBr在高pH值下与碳水化合物反应，代表性的pH值在10-12。在该高pH值下，与碳水化合物的羟基生成氰酸酯。进而与双官能试剂通常为二胺或二酰肼反应。这些衍生的碳水化合物通过双官能基团可被结合。在某些有限的情况下，氰酸酯也可直接与蛋白质反应。高pH值对于羟基离子化是必需的，因为反应需要羟离子亲核攻击氰酸离子(CN-)。结果，CNBr产生许多副反应，其中一些将新抗原加到多糖上。Wilcheck，M.等人，Affinity Chromatography.Meth.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备结合疫苗的方法，包括： （ａ）使含至少一羰基的第一部分与至少一种氨基－氧基试剂反应形成第一部分上的至少一个侧链官能团，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子； （ｂ）使含至少一个侧链官能团的第一部分与第二部分反应形成含结合物的组合物，其中第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和 （ｃ）结合物与药物可接受的递送载体组合形成结合疫苗。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A利斯，
申请(专利权)人：比奥辛耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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