【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及用于pcr扩增的添加剂、多重pcr扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
1、目前，结核病成为严重影响全球的公共健康问题，结核病诊疗现状是发病率高，而患者细菌学检测率低；耐多药的结核病高发、耐药结核患者实验室检出率低。现有临床应用的主要诊断方法除了病史及体格检查外，还包括细菌学培养(金标准)、分子生物学方法检测、影像学检测、免疫学检测(结核潜伏感染)和病理学检测等。
2、分子生物学方法检测大致分为两类：一类是结核杆菌种特异性的分子检测。包括实时荧光定量pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)检测、半巢式全自动实时荧光定量pcr检测、环介导等温扩增法(lamp，loop-mediated isothermalamplification)、实时荧光核酸恒温扩增检测技术、交叉引物扩增技术(cpa，cross-priming amplification)等。另一类是先采用通用pcr引物对核酸片段进行扩增，对扩增样本进行核酸测序后，对测序数据进行分析。与此同时，很多新技术(mngs(metagenomicsnext-generation sequencing，宏基因组测序mngs)、转录组和代谢组)在不断进步，为分子生物学检测提供更多可选择的方案。
3、目前已有众多检测结核杆菌耐药性的方法，但是现有技术主要从优化设计结核耐多药相关基因的引物和优化dna扩增酶这两方面提高检测效果。在多重pcr扩增中，随着扩增靶点的增多，仅通过优化引物设计和dna扩增酶的选择，已
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于pcr扩增的添加剂、多重pcr扩增试剂盒及其应用。本专利技术所述添加剂添加在多重pcr体系后，对多重pcr的扩增效率和扩增特异性有促进的作用，在多重pcr中具有重要的应用前景。本专利技术还提供了一种多重pcr扩增试剂盒，所述试剂盒中各组分相互配合，能够对目标基因实现优异的扩增效果。本专利技术还提供了一种采用所述试剂盒检测结核分枝杆菌耐药性的方法，所述方法的测序均一性好，人源基因组存在的情况下，结核dna占比在百万分之时均可以成功扩增且测序。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种用于pcr扩增的添加剂，所述添加剂中含有苯扎溴铵(bkb)。
4、可选的，所述苯扎溴铵在pcr扩增体系中的质量浓度为0.001-0.1％。
5、可选的，所述苯扎溴铵在pcr扩增体系中的质量浓度为0.005-0.1％。
6、可选的，所述添加剂还包括四甲基氯化铵(tmac)和/或四聚乙二醇单月桂醚(theist)。
7、可选的，所述添加剂还包括牛血清白蛋白、聚乙二醇或二甲基亚砜中的至少一种。
8、可选的，所述添加剂为苯扎溴铵和四甲基氯化铵的组合。
9、可选的，所述添加剂在pcr扩增体系中的质量浓度计为：0.001-0.1％苯扎溴铵和0.1-0.5％四甲基氯化铵。
10、可选的，所述添加剂为苯扎溴铵和四聚乙二醇单月桂醚的组合。
11、可选的，所述添加剂在pcr扩增体系中的质量浓度为：0.001-0.1％苯扎溴铵和0.001-0.2％四聚乙二醇单月桂醚。
12、可选的，所述添加剂为苯扎溴铵、四甲基氯化铵和四聚乙二醇单月桂醚的组合。
13、可选的，所述添加剂在pcr扩增体系中的质量浓度为：0.001-0.1％苯扎溴铵、0.1-0.5％四甲基氯化铵和0.001-0.2％四聚乙二醇单月桂醚。
14、可选的，所述添加剂用于多重pcr扩增。
15、第二方面，本专利技术提供一种多重pcr扩增试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于pcr扩增的添加剂。
16、可选的，所述试剂盒中还包括引物组合物。
17、可选的，所述引物组合物包括一个或一个以上的引物对，且所述引物选自seq idno:1-174所示的核苷酸序列。
18、可选的，所述引物组合物为seq id no:1-174所示的核苷酸序列。
19、可选的，所述试剂盒中还包括pcr扩增试剂，所述pcr扩增试剂包括：kcl、mgcl2、tris-hcl、dntp和dna聚合酶。
20、第三方面，本专利技术提供第二方面所述的多重pcr扩增试剂盒在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用。
21、第四方面，本专利技术提供一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，所述方法包括：
22、采用第二方面所述的多重pcr扩增试剂盒对结核分枝杆菌培养物进行多重pcr扩增；对扩增产物进行测序；基于测序结果，判断结核分枝杆菌的耐药性。
23、本专利技术所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
24、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
25、(1)在单重pcr扩增时，含有苯扎溴铵的扩增试剂，特别是扩增体系中0.001-0.1％浓度范围内的苯扎溴铵，能够提高pcr反应的扩增效率和扩增特异性。
26、(2)多重pcr扩增时，三种添加剂组合(0.001-0.1％苯扎溴铵、0.1-0.5％四甲基氯化铵和0.001-0.2％四聚乙二醇单月桂醚)，能够提高pcr反应的扩增效率和特异性，反应体系种引物对增加至74对时，引物也均能扩增。
27、(3)本申请还设计了结核耐药相关位点检测的引物组合，上述引物组合与本申请所述添加剂组合联合应用时，获得了较好的检测效果。
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1.一种用于PCR扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂中含有苯扎溴铵。
2.根据权利要求1所述的用于PCR扩增的添加剂，其特征在于，所述苯扎溴铵在PCR扩增体系中的质量浓度为0.001-0.1％。
3.根据权利要求1或2所述的用于PCR扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂还包括四甲基氯化铵和/或四聚乙二醇单月桂醚；
4.根据权利要求3所述的用于PCR扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂为苯扎溴铵和四甲基氯化铵的组合；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于PCR扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂用于多重PCR扩增。
6.一种多重PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的用于PCR扩增的添加剂。
7.根据权利要求6所述的多重PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括引物组合物。
8.根据权利要求7所述的多重PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述引物组合物包括一个或一个以上的引物对，且所述引物选自SEQ ID NO:1-174所示的核苷酸序列；
9.权利
10.一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其特征在于，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种用于pcr扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂中含有苯扎溴铵。
2.根据权利要求1所述的用于pcr扩增的添加剂，其特征在于，所述苯扎溴铵在pcr扩增体系中的质量浓度为0.001-0.1％。
3.根据权利要求1或2所述的用于pcr扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂还包括四甲基氯化铵和/或四聚乙二醇单月桂醚；
4.根据权利要求3所述的用于pcr扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂为苯扎溴铵和四甲基氯化铵的组合；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于pcr扩增的添加剂，其特征在于，所述添加剂用于多重pcr扩增。
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠明霞，高一凡，曾立董，周乐天，康欢欢，张国良，毕静，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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