【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞，具体地，涉及一种永生化copd人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，copd)是一种严重危害人类健康常见的慢性呼吸系统疾病，也是全球第三大死亡原因。copd主要以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的疾病，好发于小气道，即细支气管和终末细支气管。作为以上结构的主要细胞群，人支气管上皮细胞不仅是病原体及炎症介质作用的靶细胞，自身也可通过分泌促炎因子和趋化因子等活性分子，参与copd发生发展过程中如慢性气道炎性、气道重塑等重要病理改变，因此是copd病因学和进展机制探讨的主要细胞。然而，目前的研究中，在copd病因学及进展机制探索中严重缺乏copd人支气管上皮细胞，制约相关研究领域的发展。虽然目前已有成熟的永生化人正常支气管上皮细胞系(如16hbe和beas-2b)，但由于copd和正常人来源的人支气管上皮细胞在发育过程中所处的微环境不同，导致这两种细胞特定基因的表达存在差异性，且特定基因的改变使原癌基因激活或抑癌基因失活的程度不一致，及影响药物代谢酶的活性不同，导致两种细胞在肿瘤易感性及药物敏感性方面存在差异。故在copd恶性进展机制探讨及靶向药物研发中，需要copd特征性支气管上皮细胞开展体外研究。
2、目前开展以上相关研究所采用的copd人支气管上皮细胞主要由临床上copd患者肺组织分离而获得。虽然该方法极大的解决了缺少copd特征性人支气管上皮细胞的瓶颈问题，但仍存在以下不足：(1)细胞量
3、由于copd是一种长病程的慢性呼吸系统疾病，且需要长期服用药物以控制病情，因此无论在copd进展分析评估中，还是靶向新药物开发中，都迫切需要一种能稳定多次传代的copd人支气管上皮细胞，以用于机制探讨和药物毒性效应评价。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种永生化copd人支气管上皮细胞株。
2、本专利技术的第二个目的在于提供所述永生化copd人支气管上皮细胞株的构建方法。
3、本专利技术的第三个目的在于提供永生化copd人支气管上皮细胞株的应用。
4、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
5、本专利技术提供一种永生化copd人支气管上皮细胞株(homo sapiens)，所述细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏编号为cctcc no：c2023236。
6、本专利技术通过将携带猿猴病毒40的大t抗原片段(sv40-lt)逆转录病毒载体感染原代copd人支气管上皮细胞，导入sv40-lt，通过抗生素筛选并进行稳定传代，获得一种永生化copd人支气管上皮细胞株，并于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2023236，可为copd发展规律机制探索及靶向药物研发等提供稳定的细胞模型。
7、本专利技术还提供一种永生化copd人支气管上皮细胞株的构建方法，包括以下步骤：copd原代支气管上皮细胞的培养、构建过表达sv40-lt的慢病毒载体并感染copd原代支气管上皮细胞、永生化细胞筛选、鉴定。
8、进一步地，所述copd原代支气管上皮细胞的培养为用含有2％胎牛血清、1％双抗，1％表皮生长因子的专用上皮基础培养基进行培养。
9、进一步地，所述copd原代支气管上皮细胞的培养为在培养箱中培养至细胞融合度达到90％以上进行传代。
10、优选地，所述copd原代支气管上皮细胞需要进行支原体检测，其步骤为提取dna样品、pcr仪进行扩增、扩增产物进行电泳检测。支原体检测目的在于防止原代细胞中出现支原体污染，从而影响细胞永生化的进程。
11、优选地，所述copd原代支气管上皮细胞需要进行ck19蛋白免疫荧光检测，其步骤为细胞爬片、固定、破膜封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行包埋。在原代copd人支气管上皮细胞检测ck19蛋白的免疫荧光的意义在于该原代细胞是否属于支气管上皮类细胞及有无其他细胞污染。
12、进一步地，所述慢病毒载体为含有过表达sv40-lt的pbobi-large t-puro载体。
13、进一步地，所述永生化细胞筛选为使用嘌呤霉素进行筛选，每隔2天换一次新鲜培养基。
14、进一步地，所述嘌呤霉素浓度为1μg/ml。
15、优选地，所述永生化细胞筛选中，存活的细胞即为转染成功的永生化细胞，对筛选所得永生化细胞进行细胞扩增。
16、优选地，采用qrt-pcr法检测sv40-lt的表达水平，确认sv40-lt导入宿主细胞的情况。其步骤为：提取细胞rna，逆转录成cdna，上机进行qpcr检测。
17、优选地，对导入sv40-lt基因的宿主细胞进行连续7天的细胞活力检测。
18、进一步地，所述鉴定为str基因型鉴定。
19、优选地，str基因型鉴定首先需要提取细胞基因组dna，pcr扩增dna样品的str序列，经过str基因分析，最后进行数据库对比。str即短串联重复序列(short tandemrepeats)，是一段包含1-6bp的重复dna序列。通过str信息建立细胞系的遗传特性来检测细胞是否发生交叉污染或者误认的情况。
20、优选地，在永生化前后均需要对细胞进行str基因型鉴定，其目的是鉴定永生化前后是否为同一株细胞以及有无其他杂细胞交叉污染。
21、优选地，对永生化细胞进行支原体检测、ck19蛋白免疫荧光检测，以确认永生化细胞属于支气管上皮类细胞，永生化过程中未被支原体及其它细胞污染。
22、经过所述构建方法筛选获得的永生化copd人支气管上皮细胞数量明显增多，且细胞状态较原代细胞相比较为良好。永生化copd人支气管上皮细胞传代次数相比于原代细胞极大程度上增加，在培养至30代以上仍然保持稳定的状态，尚未出现衰老。提高了copd人支气管上皮细胞培养的可控性和稳定性。在培养过程中，永生化copd人支气管上皮细胞的抗污染能力增强，且生长速度由每代的10～15天缩短至2～3天，极大程度缩短体外培养时间。
23、因此，本专利技术提供永生化copd人支气管上皮细胞在以下方面的应用：
24、(1)c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种永生化COPD人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述永生化COPD人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。
2.一种构建权利要求1所述永生化COPD人支气管上皮细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：COPD原代支气管上皮细胞培养，构建过表达SV40-LT的慢病毒载体并感染COPD原代支气管上皮细胞，永生化细胞筛选、鉴定。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述慢病毒载体为含有过表达SV40-LT的pBobi-Large T-puro载体。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述永生化细胞筛选为使用嘌呤霉素筛选。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述鉴定为STR基因型鉴定。
6.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在COPD病因形成及进展的分析评估中的应用。
7.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在构建COPD细胞模型中的应用。
8.权利要求1所述的永生化COPD人支气管
9.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在开发COPD药物靶点中的应用。
10.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在筛选和/或评价/制备COPD治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种永生化copd人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述永生化copd人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2023236。
2.一种构建权利要求1所述永生化copd人支气管上皮细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：copd原代支气管上皮细胞培养，构建过表达sv40-lt的慢病毒载体并感染copd原代支气管上皮细胞，永生化细胞筛选、鉴定。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述慢病毒载体为含有过表达sv40-lt的pbobi-large t-puro载体。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述永生化细胞筛...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋义国，周芸，李赛凤，邱丽秋，钟程慧，蓝美琪，刘跃伟，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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