【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于溶血葡萄球菌检测，具体涉及溶血葡萄球菌的数字pcr检测的引物探针及其试剂盒与应用。
技术介绍
1、溶血葡萄球菌是广泛定植于皮肤、毛囊上的化脓性革兰阳性菌。作为凝固酶阴性葡萄球菌(cns)家族中的一员，溶血葡萄球菌会分泌很多致病物质：血浆凝固酶，凝固酶阳性菌株进入机体后，使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被杀死。同时，凝固酶集聚在菌体四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的作用。溶血葡萄球菌，尤其是引起院内感染的菌株，比其他凝固酶阴性葡萄球菌对抗生素更耐药；有明确的证据表明，其他葡萄球菌可以通过溶血葡萄球菌获得抗性基因。溶血葡萄球菌可引起严重感染，例如皮肤感染、脑膜炎、心内膜炎、人工关节感染、菌血症、败血症、腹膜炎和中耳炎，尤其是在免疫功能低下患者中。此外，在狗、品种犬舍和食用动物中检测到溶血葡萄球菌属。致病性溶血葡萄球菌分离株的主要特征是形成生物膜，该生物膜参与导管相关感染和其他院内感染。溶血葡萄球菌比其他cns菌株更容易产生耐药性，这可能是由于其生物膜形成能力；临床诊断的延误会导致健康状况恶化，因此溶血葡萄球菌的快速诊断对于精准治疗至关重要。eliezer m.pereira等人研究发现，hmg-coa还原酶(mvaa)作为溶血葡萄球菌的特异性基因，mvaa仅在溶血葡萄球菌样本中表现为阳性，在金黄色葡萄球菌以及表皮葡萄球菌均表现为阴性，实验结果表明，mvaa基因可用于溶血葡萄球菌的快速鉴定及检测。
2、传统的检测方法是进行细菌培养或pcr联合测序，但细菌
3、用于溶血葡萄球菌鉴定的一些常规方法是糖发酵试验、细菌培养法、基于表型的方法、免疫学测定和聚合酶链反应(pcr)等。但是，这些方法存在以下限制：例如，细菌培养方法既费时又费力；基于表型的方法，如vitek系统(生物梅里埃)和api id 32葡萄球菌(生物梅里埃)，非常耗时；chiang等人设计了一种基于groesl序列的显色微阵列系统，在12小时内同时检测样品中的大多数葡萄球菌。此外，基于pcr的溶血葡萄球菌鉴定(首次设计于1992年)需要近20小时，然而，pcr取决于多种因素，例如精密仪器、训练有素的技术人员和多步骤过程，因此不方便进行即时检测(poct)和溶血葡萄球菌的快速诊断，因此，建立一种识别溶血葡萄球菌poct的方法对于服务不足地区的快速疾病诊断和治疗具有重要意义。
4、数字pcr(dpcr)是第三代pcr技术，是一种可实现绝对定量的pcr。芯片式数字pcr制备方式采用的也是“固相分割”路线，利用mems工艺刻蚀加工晶圆，形成微米级腔室，微体系反应液在固相微腔中完成pcr过程，避免了交叉干扰和剧烈热反应造成的稳定性破坏。在此基础上，微体系组分的变化并不影响物理结构，从而为平台带来了更强的开放性。芯片式除了均一稳定的优势之外，还有一些其他的特点，每个微单元可以独立观测、芯片可以反复阅读、图像可以溯源等等，非常利于研发人员进行分析和溯源。芯片式数字pcr将靶标核酸分子稀释到大量的独立反应单元中，每个反应单元包含一个或多个，或不包含目标dna模板，每个反应单元间独立平行扩增，扩增结束后含有靶标分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出靶标分子的浓度或拷贝数，无需标准曲线即可对靶标分子进行绝对定量。目前该技术已在微生物检测、转基因植物检测、疾病诊断、食品安全等方面发挥重要作用。但目前尚没有关于溶血葡萄球菌的数字pcr检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的，提供一种溶血葡萄球菌的数字pcr检测引物探针组和试剂盒，本专利技术的另一目的是提供该引物探针组、试剂盒的应用。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种溶血葡萄球菌的数字pcr检测引物探针组，包括序列如seq idno.16-17所示的引物对和序列如seq id no.18所示的探针。
4、作为优选实施方式，所述探针两端分别带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为fam、rox、vic、cy5.5、atto 425、和cy5中的一种，所述淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3和mgb中的一种。
5、本专利技术还提供一种包含所述的引物探针组的试剂盒。
6、作为优选实施方式，所述试剂盒还包括选自pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntp、发生油、阳性标准品和阴性标准品中的一种或多种。
7、本专利技术还提供一种所述的引物探针组在检测溶血葡萄球菌中的应用。
8、本专利技术还提供一种溶血葡萄球菌的检测方法，提取待测样品基因组dna，序列如seq id no.16-17所示的引物对和序列如seq id no.18所示的探针进行数字pcr扩增；所述数字pcr扩增的反应体系中，所述引物对和所述探针的浓度均为0.5μm。
9、作为优选实施方式，所述数字pcr扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火45s，共45个循环。
10、作为优选实施方式，所述数字pcr为芯片式数字pcr。
11、作为优选实施方式，根据溶血葡萄球菌侵染的拷贝数判断待测样本是否被溶血葡萄球菌侵染。
12、本专利技术还提供一种采用所述的试剂盒用于检测溶血葡萄球菌病原体的非诊断用途。
13、与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
14、本专利技术根据溶血葡萄球菌的mvaa基因序列设计特异性引物和荧光探针，通过对引物和探针以及反应体系和反应条件的优化，建立了可对溶血葡萄球菌实现准确定量的数字pcr检测方法。本专利技术的引物和探针具有良好的特异性；而且扩增的线性相关良好(r2＝0.9998)；经实验验证，本专利技术的溶血葡萄球菌的数字pcr检测引物和探针以及检测方法可应用于实际临床样本的检测，准确定量核酸拷贝，结果准确可靠，为溶血葡萄球菌感染相关疾病的早期发现、预防和治疗提供高效的绝对定量检测方法，具有重要的应用价值。使用本专利技术的试剂盒，从上样到检测结果仅需2小时左右的时间。因此，本专利技术的试剂盒特别适用于临床标本的快速定量检测。
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1.溶血葡萄球菌的数字PCR检测引物探针组，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO.16-17所示的引物对和序列如SEQ ID NO.18所示的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针两端分别带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、CY5.5、ATTO 425、和CY5中的一种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB中的一种。
3.包含权利要求1或2所述的引物探针组的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、发生油、阳性标准品和阴性标准品中的一种或多种。
5.权利要求1或2所述的引物探针组在检测溶血葡萄球菌中的应用。
6.一种溶血葡萄球菌的检测方法，其特征在于，提取待测样品基因组DNA，序列如SEQID NO.16-17所示的引物对和序列如SEQ ID NO.18所示的探针进行数字PCR扩增；所述数字PCR扩增的反应体系中，所述引物对和所述探针的浓度均为0.5μM。
7.根据权
8.根据权利要求1-2任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述数字PCR为芯片式数字PCR。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，根据溶血葡萄球菌侵染的拷贝数判断待测样本是否被溶血葡萄球菌侵染。
10.一种采用如权利要求3所述的试剂盒用于检测溶血葡萄球菌病原体的非诊断用途。
...【技术特征摘要】
1.溶血葡萄球菌的数字pcr检测引物探针组，其特征在于，包括序列如seq id no.16-17所示的引物对和序列如seq id no.18所示的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针两端分别带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为fam、rox、vic、cy5.5、atto 425、和cy5中的一种，所述淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3和mgb中的一种。
3.包含权利要求1或2所述的引物探针组的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntp、发生油、阳性标准品和阴性标准品中的一种或多种。
5.权利要求1或2所述的引物探针组在检测溶血葡萄球菌中的应用。
6.一种溶血...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵嘉丽，王会敏，
申请(专利权)人：臻准生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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