【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器，具体涉及一种金属有机框架材料高效固定化乙酰胆碱酯酶的新方法，并构建基于ache@zn-mof-74的有机磷农药生物传感器用于水体中毒死蜱动态降解监测。
技术介绍
1、基于生物酶构建的传感器在临床诊断、环境监测和食品安全检测等方面得到广泛研究。生物酶的催化特异性和优异活性，表现出生物识别和信号放大功能，直接决定了生物传感器的检测性能。然而，酶三维结构固有的脆弱性使其在苛刻条件下(高温、有机溶剂等)极易变性，活性位点或独特的空间结构容易被破坏而导致生物酶活性降低或失活，这极大地阻碍了其生物传感器的产业化发展。
2、金属有机骨架材料(mofs)是一类新兴的多孔材料，具有良好的孔隙结构和晶体结构、良好的生物相容性、良好的化学/机械稳定性和较高的比表面积，是开发酶@mofs复合材料的理想宿主基质。然而，当酶构象受到mofs空间结构限制时，大多数生物酶活性会降低，不利于底物或产物的传输以及内部酶与底物之间的结合，因此酶的表观生物活性较低。此外，在典型的原位合成过程中，mofs通常在极性有机溶剂中制备，这导致酶严重失活。目前，越来越多的研究开始探讨微环境控制的晶体缺陷生长以及调节酸度蚀刻表面增加孔径来获得高活性的酶@mofs(@代表封装)，该方法可能会损害mofs的晶体结构和分子筛效应，导致mofs框架坍塌，对恶劣外部环境的抵抗能力降低。因此，要提高酶@mofs的性能，必须深入揭示酶包封过程中的动态入口和相关机理，以及mofs结构对固定化酶生物功能的影响，并采用替代技术，组装出具有适当空腔形状的mofs复
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种乙酰胆碱酯酶(ache)的高效固定化方法，并构建基于ache@zn-mof-74的有机磷农药生物传感器实现水体中毒死蜱动态降解监测。
2、本专利技术采用生物相容性良好的锌基mof(zn-mof-74)原位固定化ache，以ache为成核和框架生长的调节剂，快速合成ache@zn-mof-74复合材料。含有丰富氨基酸残基(谷氨酸、天冬氨酸等)的ache可通过静电作用、氢键与zn2+结合，从而破坏zn-h4dobdc的初始构型，实现从zn-mof-74六方棒状到纳米花结构的形态演变。其中zn-mof-74提供的亲水性框架微环境，可以维持ache的生物构象，花状结构可以促进底物和产物的传质过程，实现了酶的高效负载、高活性保持的效果。ache@zn-mof-74复合材料的生物活性与等效的游离酶相似，这是第一个具有高生物活性的ache封装实例。ache@zn-mof-74复合材料作为目标识别和信号放大单元，在恶劣环境中表现出良好的稳定性，结合有机磷农药对ache活性的不可逆抑制作用，构建用于有机磷农药高灵敏检测的生物传感器，并应用于实际稻田水中农药降解的监测，为食品安全检测和环境有毒有害物监测提供技术支撑，也为精准农业的发展提供可靠的工具。
3、本专利技术所述的一种乙酰胆碱酯酶的高效固定方法及在有机磷农药降解监测的应用，其步骤如下：
4、a、ache@zn-mof-74、ache@zif-90、ache@zif-8复合材料的制备：
5、ache@zn-mof-74制备：将zn(no3)2·6h2o(74.96mg)、2,5-二羟基对苯二甲酸(h4dobdc，10mg)和乙酰胆碱酯酶(ache，5mg)溶于8mltris-hcl缓冲液(50mmol/l，ph＝8)，室温下搅拌10min，得到的混合物在4320rpm下离心10min，超纯水洗涤2次，随后用超纯水复溶，4℃储存备用。
6、ache@zif-90制备：将148mg zn(no3)2·6h2o溶解于1.2ml超纯水中。将含有ica(192mg)、pvp(20mg)和ache(5mg)的超纯水10ml在42℃下搅拌溶解。加入硝酸锌溶液，搅拌10min。随后在10000rpm离心，超纯水洗涤，复溶，4℃储存备用。
7、ache@zif-8制备：2-甲基咪唑(2.27g)溶于8ml超纯水中，缓慢加入2ml含硝酸锌(0.117g)和ache(5mg)的超纯水。搅拌10min后，溶液变成乳白色。然后，将溶液在10000rpm下离心10min，用超纯水洗涤。最后，将得到的复合材料再分散到超纯水中，4℃储存备用。
8、b、ache@zn-mof-74的形态演变及性能研究
9、形态演变：将zn(no3)2·6h2o(74.96mg)、2,5-二羟基对苯二甲酸(h4dobdc，10mg)和乙酰胆碱酯酶(ache，5mg)溶于8mltris-hcl缓冲液(50mmol/l，ph＝8)，分别在10s、60s、240s、360s取3μl液体滴到铜网上，待其干燥，随后用透射电镜(tem)拍摄形貌。
10、活性比较：将50μl材料(等质量浓度的ache@zn-mof-74、ache@zif-90、ache@zif-8)分别与200μlpbs(10mmol/l，ph＝7.4)、50μl水和100μlatch(10mmol/l)混合。37℃孵育30min后，加入100μldtnb(0.3mg/ml)，离心后在412nm处测定吸光度。
11、稳定性：50μl游离ache分别用等体积的蛋白酶k、dmso、hcl和温度(50℃和70℃)处理30min。随后，加入200μlpbs(10mmol/l)和100μlatch(10mmol/l)，在37℃下混合孵育30min，最后加入100μl dtnb(0.3mg/ml)。在412nm处测定吸光度。ache@zn-mof-74的稳定性与上文相同，只是游离ache被ache@zn-mof-74取代。
12、c、比色传感平台构建及“抑制率－毒死蜱浓度”的标准曲线绘制：
13、将毒死蜱标准溶液用超纯水进行稀释，得到不同浓度的毒死蜱溶液(1ng/ml～600ng/ml)，各取50μl与ache@zn-mof-74复合材料水溶液按体积比1∶1混合均匀，在37℃下孵育40min后加入200μlpbs缓冲液(ph＝7.4，10mmol/l)和100μl碘化乙酰硫代胆碱水溶液(atch，10mmol/l)，混合均匀，在37℃下孵育30min，再加入100μl 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb，0.3mg/ml)，测定混合后溶液在412nm处的吸光度。
14、抑制率(ie％)计算公式如下：
15、
16、式中，a0为比色传感平台的基线强度，a1为ache@zn-mof-74比色传感平台的吸收强度，a为加入不同浓度毒死蜱后体系的吸收强度。
17、计算获得不同浓度毒死蜱对应的抑制率，从而建立“抑制率－毒死蜱浓度”的标准关系曲线。实际应用中，可以利用上述比色传感平台采集未知毒死蜱浓度溶液的图像，获得对应的吸光度，计算出相对应的抑制率，代入该“抑制率－毒死蜱浓度”的标准关系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乙酰胆碱酯酶高效固定方法，其步骤如下：
2.一种乙酰胆碱酯酶高效固定方法，其特征在于：AChE@Zn-MOF-74复合材料的制备采用原位合成固定化酶的方法，这是第一个成功原位固定乙酰胆碱酯酶的例子。
3.一种乙酰胆碱酯酶高效固定检测有机磷农药，其特征在于：是由权利要求1所述方法得到。
4.如权利要求3所述的一种基于乙酰胆碱酯酶高效固定检测有机磷农药并在现场快速检测毒死蜱的应用，其特征在于：是将毒死蜱标准溶液用超纯水进行稀释，得到1ng/mL～600ng/mL不同浓度的毒死蜱溶液，与50μLAChE@Zn-MOF-74复合材料水溶液按体积比1∶1混合均匀，在37℃下孵育40min，得到溶液A；然后，将100μL 10mmol/L碘化乙酰硫代胆碱水溶液和200μL条件为pH＝7.4，10mmol/LPBS缓冲液加入到溶液A中，并在37℃下孵育30min得到反应溶液；孵育完成后将100μL 0.3mg/mL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)加入反应溶液中，测定混合后溶液在412nm处的吸光度，按上述步骤制作AChE@Zn-MOF-74比色
5.如权利要求4所述的一种基于乙酰胆碱酯酶高效固定检测有机磷农药并在现场快速检测毒死蜱的应用，其特征在于：用于毒死蜱在稻田水、松花江水中的降解残留监测。
...【技术特征摘要】
1.一种乙酰胆碱酯酶高效固定方法，其步骤如下：
2.一种乙酰胆碱酯酶高效固定方法，其特征在于：ache@zn-mof-74复合材料的制备采用原位合成固定化酶的方法，这是第一个成功原位固定乙酰胆碱酯酶的例子。
3.一种乙酰胆碱酯酶高效固定检测有机磷农药，其特征在于：是由权利要求1所述方法得到。
4.如权利要求3所述的一种基于乙酰胆碱酯酶高效固定检测有机磷农药并在现场快速检测毒死蜱的应用，其特征在于：是将毒死蜱标准溶液用超纯水进行稀释，得到1ng/ml～600ng/ml不同浓度的毒死蜱溶液，与50μlache@zn-mof-74复合材料水溶液按体积比1∶1混合均匀，在37℃下孵育40min，得到溶液a；然后，将100μl 10mmol/l碘化乙酰硫代胆碱水溶液和200μl条件为ph＝7.4，10mmol/lpbs缓冲液加入到溶液a中，并在37℃下孵育30...
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