【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体涉及到一种多突变位点的非特异性过加氧酶及其在合成25-羟基维生素d3中的应用。
技术介绍
1、25-羟基维生素d3是维生素d3的第一个代谢产物，也是维生素d3在血液循环中的主要活性形式，其直接进入血液，不需要经过肝脏代谢，生物效价是维生素d3的3～5倍，未来有望取代维生素d3成为畜禽养殖必不可少的维生素之一。在畜禽养殖中，25-羟基维生素d3主要发挥三个核心功能：一是提高血钙含量，增强骨密度；二是提高精子质量、增加胚胎着床率，提高出生率以及孵化率；三是促进机体产生免疫球蛋白，提升免疫力。
2、传统的工业生产方式是化学法和生物法。化学法首先需要在分离车间中将复合胆固醇通过分离萃取、去氢粗品等过程制备得到25-羟基胆固醇粗品。随后在热化车间经过结晶、酰化、氧化、制腙、脱腙、皂化等过程，将25-羟基胆固醇粗品转化为25-羟基-7-去氢胆固醇。最后，在光化车间内，经过光照开环、柱分离后获得25-羟基维生素d3结晶。化学合成方法存在反应步骤多、需要昂贵试剂、有机溶剂用量大、对环境污染强等缺点。生物法分为生物发酵法和生物催化法。生物发酵法是在微生物发酵过程加入前体维生素d3，经微生物体内特定酶转化为25-羟基维生素d3，该方法生产条件温和、环境友好，但目前也存在产品浓度低(小于1g/l)、发酵液成分复杂、发酵周期长等问题，严重影响后提取效率。生物催化法主要是利用基因工程技术制备特定的氧化酶，在体外特异性地氧化维生素d3生成25-羟基维生素d3，产物纯度高。但目前报道的该方法普遍存在底物浓度低(小于1g
3、因此，利用蛋白质工程技术对特定酶分子进行改进优化，提高催化效率，简化反应体系，使其能够更好地满足生产工艺需求，成为开发25-羟基维生素d3绿色合成技术的重要研究方向。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种多突变位点的非特异性过加氧酶。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：包括，
5、将氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型非特异性过加氧酶taupo的第182位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第265位的甲硫氨酸突变为缬氨酸得到的氨基酸序列如seq id no.4所示的突变体酶taupomut1；还包括，
6、将氨基酸序列如seq id no.2所示的非特异性过加氧酶taupo的第124位精氨酸突变为亮氨酸，第182位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第265位的甲硫氨酸突变为缬氨酸，第310位的甘氨酸突变为脯氨酸得到的氨基酸序列如seq id no.6所示的突变体酶taupomut2。
7、作为本专利技术所述多突变位点的非特异性过加氧酶的一种优选方案，其中：所述氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型非特异性过加氧酶taupo的核苷酸序列如seq idno.1所示；
8、所述氨基酸序列如seq id no.4所示的突变体酶taupomut1的核苷酸序列如seqid no.3所示；
9、氨基酸序列如seq id no.6所示的突变体酶taupomut2的核苷酸序列如seq idno.5所示。
10、本专利技术的另一目的是，提供编码所述非特异性过加氧酶的基因。
11、本专利技术的另一目的是，提供一种重组质粒，包含所述非特异性过加氧酶的基因序列。
12、本专利技术的另一目的是，提供一种宿主细胞，包含所述非特异性过加氧酶的重组质粒。
13、本专利技术的另一目的是，提供一种所述的非特异性过加氧酶在催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3中的应用，包括，
14、羟丙基-β-环糊精、维生素d3、过氧化氢以及如权利要求1所述的非特异性过加氧酶溶于磷酸钾缓冲液中组成反应混合液，搅拌反应，生成25-羟基维生素d3。
15、作为本专利技术所述多突变位点的非特异性过加氧酶催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3中的应用的一种优选方案，其中：所述反应混合液中非特异性过加氧酶的浓度为1200～2000u/l、羟丙基-β-环糊精浓度为20～80g/l、过氧化氢浓度为3～30mmol/l、维生素d3浓度为1～10g/l。
16、作为本专利技术所述多突变位点的非特异性过加氧酶催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3中的应用的一种优选方案，其中：所述磷酸钾缓冲液的浓度为50～100mmol/l，ph为7～8。
17、作为本专利技术所述多突变位点的非特异性过加氧酶催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3中的应用的一种优选方案，其中：所述搅拌反应的温度未35～45℃，搅拌反应的时间为24h。
18、本专利技术有益效果：
19、(1)本专利技术提供了一种催化活性高、底物耐受性好的改进的非特异性过加氧酶,与野生型酶相比，改进的酶在底物结合区域、亚基界面及酶分子表面发生氨基酸残基突变，使得酶分子在催化效率和稳定性方面的性能得到显著改善。本专利技术改进的非特异性过加氧酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌和发酵培养大量制备，相对廉价易得。
20、(2)本专利技术改进的非特异性过加氧酶在催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3过程中，转化率能够达到99％以上，大大提高了25-羟基维生素d3的制备效率；且反应为“一锅煮”式，所有原料同时加入，反应后直接得到终产物25-羟基维生素d3，中间无需分离提纯，反应条件温和，无需使用有机溶剂，反应体系更绿色环保，具有较好的工业应用前景。
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1.一种多突变位点的非特异性过加氧酶，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的多突变位点的非特异性过加氧酶，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型非特异性过加氧酶TaUPO的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
3.编码如权利要求1或2所述非特异性过加氧酶的基因。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求2所述的突变体的基因序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求1所述的非特异性过加氧酶在催化维生素D3发生氧化反应生成25-羟基维生素D3中的应用。
7.如权利要求6所述的非特异性过加氧酶在催化维生素D3发生氧化反应生成25-羟基维生素D3中的应用，其特征在于：包括，
8.如权利要求7所述的非特异性过加氧酶的应用，其特征在于：所述反应混合液中非特异性过加氧酶的浓度为1200～2000U/L、羟丙基-β-环糊精浓度为20～80g/L、过氧化氢浓度为3～30mmol/L、维生素D3浓度为1～10g/L。<...
【技术特征摘要】
1.一种多突变位点的非特异性过加氧酶，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的多突变位点的非特异性过加氧酶，其特征在于：所述氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型非特异性过加氧酶taupo的核苷酸序列如seq id no.1所示；
3.编码如权利要求1或2所述非特异性过加氧酶的基因。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求2所述的突变体的基因序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求1所述的非特异性过加氧酶在催化维生素d3发生氧化反应生成25-羟基维生素d3中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：高新星，蔡王水，张鑫，梁吉雷，何清明，
申请(专利权)人：泰州学院，
类型：发明
国别省市：
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