本发明专利技术属于免疫荧光检测技术领域，公开了一种荧光淬灭免疫层析试纸条及其制备方法，荧光淬灭免疫层析试纸条由ACE2偶联绿色荧光微球ACE2‑FNPs、RBD标记纳米金RBD‑AuNPs、NC膜、PVC板以及卡壳组成。荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法包括：利用氯金酸和柠檬酸三钠进行胶体金溶液的制备；利用胶体金、重组RBD蛋白和BSA进行RBD‑AuNPs的制备；利用荧光微球FNPs分别偶联ACE2和BSA并进行试纸条组装。本发明专利技术利用独有的基于荧光共振能量转移的荧光淬灭免疫层析平台开发了一种用于新冠病毒中和抗体快速检测的阻断法荧光淬灭免疫层析试纸条，能实现新冠病毒中和抗体的精准、快速、高灵敏检测。
1、在疫苗接种后，对人体的保护力进行评价尤为重要，可根据评价结果给出是否需要疫苗接种或加强免疫的建议。此外，普及群众的中和抗体快速检测可建立人群保护力准入白名单，具有相当中和抗体水平的人群，考虑正常生活和工作，这有重要的临床意义和社会价值。
2、sars-cov-2是一种带有包膜的正链rna病毒，具有四个主要结构蛋白：s蛋白(spike protein)，n蛋白(nucleocapsidprotein)，e蛋白(envelope protein)和m蛋白(membrane protein)。s蛋白是使sars-cov-2进入细胞的关键，因为它在与细胞受体和膜融合中起重要作用。s蛋白包含s1和s2两个功能性亚基，其中s1亚基上的rbd结构域负责与宿主细胞受体ace2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)结合，s2亚基负责将s蛋白锚定在宿主细胞膜上并介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。当sars-cov-2进入体内后，会激活免疫应答产生针对sars-cov-2的抗体，其中针对rbd的抗体可结合病毒的rbd位点，阻断病毒与ace2结合，从而阻止了sars-cov-2感染细胞，因此，rbd是疫苗开发的最主要靶点，可阻断rbd的抗体即为中和抗体。从上述sars-cov-2的感染机制可得知，检测病毒中和抗体的关键是在于检测体内抗rbd并阻止rbd与ace2结合的抗体，同时这也是检测技术的关键所在。
>3、中和抗体检测的实验室金标准是活病毒中和试验(conventional virusneutralization test，cvnt)，其使用定量的活病毒与不同稀释度的等量血清混合的样本进行蚀斑减少中和试验(plaque reductionneutralization test，prnt)，通过检测细胞病变(cytopathic effect，cpe)量来进行分析。由于高致病性和感染性，所以使用活病毒来评估中和抗体的测试程序都不得不在生物安全级别(bsl)3的实验室下进行，这难以实现大规模常规实验室检测及快速化检测。为了解决这个难点，假病毒中和试验(pseudovirus-based vnt，pvnt)被开发用于中和抗体检测，尽管pvnt可在生物安全级别(bsl)2的实验室里进行，但依然需要复杂的操作以及耗费2～4天的时间来完成，满足不了时代大规模疫苗接种所带来的大量中和效力评估的需求。在此背景下，替代病毒中和试验(surrogate vnt，svnt)被开发出来用于中和抗体检测，该方法在酶标板中模拟rbd与ace2结合的过程，使用elisa或化学发光免疫分析的操作流程，可在普通检验室里进行，2小时即可完成检测。然而，svnt需要用到大型的检测仪器，操作时间也比较长，无法即时得出结果，因此也难以在普及人群中和抗体检测中推广。综上所述，研究针对中和抗体的快速、简单、准确的检测方法，用于对大规模人群中和抗体的监测，从而认识社会整体的免疫屏障具有重要价值。4、免疫层析试纸条由于其操作简单、检测快速、便携性、低成本等优点，已成为poct即时检测和家庭自测中日益重要的体外诊断技术。因此，十分适合用于开发病毒中和抗体的快速检测试剂，实现人群中和抗体的即时、现场检测。
5、检测抗体通常使用间接法完成，因此间接法试纸条首先被开发用于病毒中和抗体的快速检测，如比利时coris bioconcept公司的covid-19sero np/rbd test(灵敏度71.6％，特异度89.3％)和德国concile gmbh公司的infectcheck covid-19nab test(灵敏度98.4％，特异度58.3％)，然而，间接法的交叉反应率较高，灵敏性和特异性都比较低，导致容易发生假阳性和漏检。此外，间接法对二抗原料的要求较高，导致其成本增加，不利于向大众推广。
6、检测抗体的另一种常用的方法是双抗原夹心法试纸条，其只需要使用重组rbd蛋白即可建立，开发周期短、成本低，因此被应用于中和抗体的检测。然而，双抗原夹心法利用了抗体的双价特性，只要是针对rbd的抗体都能被检出，但是有很多rbd的抗体并没有阻断rbd与ace2结合的和作用，因此很容易造成假阳性，双抗原夹心试纸条检测中和抗体的结果与svnt的结果总符合率为92％，其中阴性符合率只有50％，假阳性率较高，不能真实反映人群的保护效力。
7、随着重组蛋白表达技术的发展，模拟中和抗体阻断病毒在体内侵染过程的阻断法被广泛用于中和抗体的检测，阻断法是把重组ace2蛋白固定在膜的检测线(t线)上，rbd标记信号物(胶体金、乳胶微球、荧光微球等)喷涂在结合垫上，当不存在中和抗体时，rbd与ace2结合，信号物留在膜上显示出信号，当存在中和抗体时，中和抗体先与rbd结合，从而阻断了rbd与ace2结合，不会显示出信号。由于阻断法能模拟体内的真实情况，检测到的中和抗体更加真实可靠，假阳性率更低。然而，从原理可知，该试纸条为负向信号，即有中和抗体存在没有信号，没有中和抗体存在则有信号，造成其分析灵敏度较低，容易出现假阴性导致误判。
8、有研究表明，在阻断法(t1线)的基础上增加一条利用间接法或双抗原夹心法的线(t2线)，以此来提高分析灵敏度，可有效降低假阴性，然而，这种做法使用的蛋白和抗体原料更多，产业化要求更高，此外，如果用于现场即时检测，判读结果复杂，存在难以理解的情况。
9、总结现有技术不难发现，使用简单易读、成本低的手段开发快速、准确的病毒中和抗体快速检测试纸是病毒保护力评价领域的研究趋势，也是时代重要课题。
10、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
11、(1)现有的活病毒或假病毒中和试验条件苛刻、操作复杂且耗费时间长，满足不了时代大规模疫苗接种所带来的大量中和效力评估的需求。
12、(2)替代病毒中和试验需要用到大型的检测仪器，操作时间也比较长，无法即时得出结果，因此也难以在普及人群中和抗体检测中推广。
13、(3)间接法免疫层析试纸条的灵敏性和特异性都比较低，导致容易发生假阳性和漏检；且间接法对二抗原料的要求较高，导致其成本增加，不利于向大众推广。
14、(4)由于很多rbd的抗体并没有阻断rbd与ace2结合的和作用，因此双抗原夹心法试纸条的假阳性率较高，不能真实反映人群的保护效力。
15、(5)阻断法试纸条中的检测结果为负向信号，即有中和抗体存在没有信号，没有中和抗体存在则有信号，造成分析灵敏度较低，容易出现假阴性导致误判。
16、(6)基于阻断法增加利用间接法或双抗原夹心法的线的方法使用的蛋白和抗体原料更多，产业化要求更高，判读结果复杂，存在难以理解的情况。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种荧光淬灭免疫层析试纸条及其制备方法。
2、本专利技术是这样实现的，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光淬灭免疫层析试纸条由卡壳、PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素NC膜、吸水垫组成；样品垫、结合垫、硝酸纤维素NC膜、吸水垫依次交叉重叠贴在PVC底板上，装在试纸条卡壳里，结合垫上喷涂有RBD标记纳米金RBD-AuNPs。
2.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，结合垫上喷涂有RBD标记纳米金RBD-AuNPs，其中RBD通过静电吸附作用标记到纳米金上，NC膜上的T线区域包被有ACE2偶联绿色荧光微球ACE2-FNPs，其中ACE2通过共价结合方式与FNPs偶联，NC膜上的C线区域包被有BSA偶联绿色荧光微球BSA-FNPs。
3.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，当向样品垫上滴加的样品是阴性样品，即没有中和抗体存在时，在试纸条的虹吸作用下，样品向吸水垫方向流动，样品流到结合垫时，结合垫上的RBD-AuNPs跟随液体流动，流到NC膜的T线区域，RBD与ACE2结合，形成RBD-AuNPs-ACE2-FNPs结构，AuNPs与FNPs发生荧光共振能量转移，FNPs的荧光被AuNPs淬灭了，没有荧光信号，流到NC膜的C线区域，RBD-AuNPs不与BSA-FNPs结合，FNPs发出荧光信号。
4.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，当向样品垫上滴加的样品是阳性样品，即存在中和抗体时，在试纸条的虹吸作用下，样品向吸水垫方向流动，样品流到结合垫时，样品中的中和抗体与结合垫上的RBD-AuNPs先结合，跟随液体流动，流到NC膜的T线区域，RBD无法与ACE2结合，无法形成RBD-AuNPs-ACE2-FNPs结构，FNPs正常发出荧光信号，流到NC膜的C线区域，RBD-AuNPs不与BSA-FNPs结合，FNPs发出荧光信号。换句话说，当中和抗体阴性时，T线没有荧光C线有荧光；当中和抗体阳性时，T线有荧光C线有荧光，从而实现了正向信号的读取。
5.一种实施权利要求1～4任意一项所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的胶体金溶液的制备方法包括：
7.如权利要求5所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的RBD-AuNPs的制备方法包括：
8.如权利要求5所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的荧光微球FNPs偶联ACE2和BSA包括：
9.如权利要求5所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的试纸条的组装方法包括：
10.如权利要求9所述的荧光淬灭免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，进一步，ACE2-FNPs和BSA-FNPs的划膜量为2.0μL/cm，RBD-AuNPs的喷量为2.0μL/cm；结合垫和样品垫的重叠部分为1mm。
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【技术特征摘要】
1.一种荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光淬灭免疫层析试纸条由卡壳、pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素nc膜、吸水垫组成；样品垫、结合垫、硝酸纤维素nc膜、吸水垫依次交叉重叠贴在pvc底板上，装在试纸条卡壳里，结合垫上喷涂有rbd标记纳米金rbd-aunps。
2.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，结合垫上喷涂有rbd标记纳米金rbd-aunps，其中rbd通过静电吸附作用标记到纳米金上，nc膜上的t线区域包被有ace2偶联绿色荧光微球ace2-fnps，其中ace2通过共价结合方式与fnps偶联，nc膜上的c线区域包被有bsa偶联绿色荧光微球bsa-fnps。
3.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，当向样品垫上滴加的样品是阴性样品，即没有中和抗体存在时，在试纸条的虹吸作用下，样品向吸水垫方向流动，样品流到结合垫时，结合垫上的rbd-aunps跟随液体流动，流到nc膜的t线区域，rbd与ace2结合，形成rbd-aunps-ace2-fnps结构，aunps与fnps发生荧光共振能量转移，fnps的荧光被aunps淬灭了，没有荧光信号，流到nc膜的c线区域，rbd-aunps不与bsa-fnps结合，fnps发出荧光信号。
4.如权利要求1所述的荧光淬灭免疫层析试纸条，其特征在于，当向样品垫上滴加的样品是阳性样品，即存在中和抗体时，在试纸条的虹吸作用下，样品向吸水垫方向流动，样品流到结合垫...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁家杰，唐勇，张晓丽，陈益消，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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