【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种基于rpa-crispr双重检测大丽轮枝菌的方法及应用。
技术介绍
1、黄栌( cotinus coggygria)为漆树科( anacardiaceae)黄栌属( cotinus)植物，落叶灌木或小乔木，秋季叶色变红，极具观赏价值和经济价值。黄栌枯萎病的病原菌为大丽轮枝菌( verticillium dahliae)，大丽轮枝菌根据其致病型可以分为落叶型和非落叶型。大丽轮枝菌是一种土传病原真菌，通过形成附着枝感染植物根部，在世界范围内引起多种植物的严重黄萎病害，包括木本树、经济作物（向日葵和棉花）、蔬菜、水果和花，造成巨大的经济损失。由于大丽轮枝菌宽泛的寄主范围和持久的土壤存活能力，很多防治措施很难达到理想的效果，因此，准确、灵敏和快速地检测大丽轮枝菌对于限制病原体进入新的区域环境和黄萎病的早期管理至关重要。
2、目前，基于聚合酶链式反应（pcr）已经开发了许多可用于检测大丽轮枝菌的方法，例如常规pcr、巢式pcr和qpcr。由于传统检测方法需要适当的培训、技术和昂贵而复杂的热循环设备，pcr检测技术在现场应用方面受到限制。等温dna扩增方法，如环介导的等温扩增（lamp）和重组聚合酶扩增（rpa），可能更适用于现场的pcr检测的替代方案。簇状规则间隔短回文重复序列（crispr）已被开发为灵敏的核酸检测工具，cas12和cas13家族能够进行集体
技术实现思路
1、本专利技术提供一种基于rpa-crispr双重检测大丽轮枝菌的方法及应用。本专利技术通过cas12和cas13相结合基于两种致病型的特异性靶标基因，采用不同的荧光报告基团进行读数，建立了双重检测大丽轮枝菌的方法，能够实现大丽轮枝菌致病型的区分，从而为大丽轮枝菌导致的黄栌枯萎病防控提供了更加精准的基础和依据。
2、本专利技术提供一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合，所述引物组合包括rpa引物对和/或crrna；
3、所述rpa引物对包括以下任一项或几项：
4、（1）包括如seq id no.1-2所示序列的引物；
5、（2）包括如seq id no.3-4所示序列的引物；
6、所述crrna包括如seq id no.5-7、seq id no.10-13中任一项所示序列。
7、优选的，所述rpa引物对和crrna的靶标基因包括大丽轮枝菌落叶型特异性基因(genbank: aj302674.2)和大丽轮枝菌的非落叶型特异性基因(genbank: aj302675.1)。
8、根据所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合，所述引物组合包括如seq id no.1-2所示序列的引物和包括如seq id no.5-7中任一项所示序列的crrna。
9、和/或,所述引物组合包括如seq id no.3-4所示序列的引物和包括如seq idno.10-13中任一项所示序列的crrna。
10、优选地，所述落叶型大丽轮枝菌的rpa引物对包括上游引物seq id no.1和下游引物seq id no.2。
11、优选地，所述非落叶型大丽轮枝菌的rpa引物对包括上游引物seq id no.3和下游引物seq id no.4。
12、优选地，所述落叶型大丽轮枝菌的crrna序列包括seq id no.5 seq id no.6 seqid no.7 的一种。
13、优选地，seq id no.6为检测落叶型大丽轮枝菌的crrna。
14、优选地，所述非落叶型大丽轮枝菌的crrna序列包括seq id no.10 seq id no.11seq id no.12 seq id no.13的一种。
15、优选的，seq id no.12为检测非落叶型大丽轮枝菌crrna。
16、优选的，用rpa-crispr/cas13来检测落叶型大丽轮枝菌，用rpa-crispr/cas12来检测非落叶型大丽轮枝菌。
17、本专利技术还提供一种用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，包括所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合。
18、根据所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，所述试剂盒还含有cas13蛋白和包括如seq id no.8所示序列的ssrna荧光探针。
19、和/或，cas12蛋白和包括如seq id no.14所示序列的ssdna荧光探针。
20、ssrna荧光探针和ssdna荧光探针的5’端荧光基团的激发光不同。
21、根据所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，所述ssrna荧光探针包括如seq id no.8所示序列。
22、和/或，所述ssdna荧光探针包括如seq id no.14所示序列。
23、本专利技术还提供一种基于rpa-crispr系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，利用所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合或所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒。
24、根据所述基于rpa-crispr系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，包括以下步骤：
25、（1）以待测样本dna为模板，进行双重rpa反应；
26、（2）将双重rpa产物进行酶切反应；
27、其中，cas13蛋白用来进行落叶型大丽轮枝菌的切割和/或cas12蛋白用来进行非落叶型大丽轮枝菌的切割；
28、（3）切割反应后进行荧光检测。
29、优选的，15µl rpa双重反应体系中包括9µl 1× reaction buffer 、rpa引物（10µm）各1µl、0.8µl乙酸镁（mgac，14mm）、1µl dna模板、余量用纯化水补足。
30、根据所述基于rpa-crispr系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，基于rpa-crispr/cas13检测落叶型大丽轮枝菌，其20μl 的反应体系包括100 nm lwacas13a、1.75 u/μl t7rna 聚合酶、1 u/μl rnase 抑制剂和2 μl模板dna。
31、优选的，包括100 nm lwacas13a(10μm) (tolobio, china)、100 nm crrna、1×r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括RPA引物对和/或crRNA；
2.根据权利要求1所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如SEQ ID NO.1-2所示序列的引物和包括如SEQ ID NO.5-7中任一项所示序列的crRNA；
3.一种用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合。
4.根据权利要求3所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有Cas13蛋白和包括如SEQ ID NO.8所示序列的ssRNA荧光探针；
5.根据权利要求4所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，所述ssRNA荧光探针包括如SEQ ID NO.8所示序列；
6.一种基于RPA-CRISPR系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，其特征在于，利用权利要求1-2任一项所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合或权利要求3-4任一项所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒。
7.根据权利要求6所述基于RPA-CRISPR系统的大丽轮枝菌致病型
8.根据权利要求7所述基于RPA-CRISPR系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，其特征在于，基于RPA-CRISPR/Cas13检测落叶型大丽轮枝菌，其20μl 的反应体系包括100 nMLwaCas13a、1.75 U/μl T7 RNA 聚合酶、1 U/μl RNase 抑制剂和2 μl模板DNA；
9.权利要求1-2任一项所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合或权利要求3-4任一项所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒在检测大丽轮枝菌中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，FAM荧光基团标记ssRNA荧光探针的5’端；
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括rpa引物对和/或crrna；
2.根据权利要求1所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如seq id no.1-2所示序列的引物和包括如seq id no.5-7中任一项所示序列的crrna；
3.一种用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述用于检测大丽轮枝菌的引物组合。
4.根据权利要求3所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有cas13蛋白和包括如seq id no.8所示序列的ssrna荧光探针；
5.根据权利要求4所述用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，所述ssrna荧光探针包括如seq id no.8所示序列；
6.一种基于rpa-crispr系统的大丽轮枝菌致病型检测方法，其特征在...
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