【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种驼源重链抗体或抗原结合片段及应用。
技术介绍
1、1.羊驼纳米抗体的特点
2、纳米抗体是天然缺失重链，只含有重链可变区的单域抗体，经典抗体分子(igg)是由两条重链和两条轻链组成，轻链包含1个vl区和1个cl区，重链包含1个 vh区和3个ch区(ch1、ch2和ch3)，轻链和重链的vh区和vl区构成抗体识别抗原的可变区(fv)，cl区和ch区称为抗体的恒定区，对抗体招募免疫细胞发挥adcc和cdc至关重要。如图1，仅由重链的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain，vhh)构成，可识别结合抗原，也可单独稳定地在体外存在的小抗体，被称为单域抗体(single domain antibody，sdab)或者纳米抗体 (nanobody，nb)或vhh抗体。纳米抗体具有完整的抗原识别能力。
3、羊驼纳米抗体于1993年首次被比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家hamers-casterman报到，这种新型抗体不仅存在于单峰驼，也在于其他骆驼科动物——双峰驼、美洲驼、羊驼、骆马和小羊驼。这种抗体天然缺失轻链，又被称为单域重链抗体，与普通抗体相比，驼源重链抗体除了缺少轻链之外，其重链可变区与铰链区之间没有ch1(conventionalregion of heavy chain，ch)区。人和鼠vh的cdr3 平均长度分别为12和9个氨基酸，而纳米抗体cdr3为13～18个氨基酸，在一定程度上弥补了轻链缺失造成的抗原
4、相对于传统抗体而言，羊驼纳米抗体稳定性好，分子量小，仅为传统完整抗体的1/10(约15kd)，其晶体直径仅为2.5nm，长4nm，因此组织穿透力强，甚至可以穿过血脑屏障；纳米抗体靠仅有的3个互补决定区(complementarity-determining region，cdr)就具备抗原的特异性和高亲和力，而普通抗体则需要6个cdrs；纳米抗体和抗原靶点结合特异性更强，能到达传统抗体无法达到的表位，由于其长的 cdr3区，能够伸入到酶的活性中性，细菌或病毒表面受体的裂缝中；也具有更高的稳定性，能耐受更加恶劣的条件如耐高温，更易储藏和运输；纳米抗体利用噬菌体筛选等技术适合工业化大规模生产，传统的通过细胞融合制备单克隆抗体周期长约6个月，而通过噬菌体展示技术能够绕开细胞的融合，更加快速的制备单克隆单体；更容易改造和人源化，纳米抗体与人抗体的重链可变区具有超过80％的序列同源性，并且二者的3d结构可以重合，因此人源化简单；另外，纳米抗体更易于构建多价和多功能抗体。
5、2.cd38抗原的应用
6、cd38抗原是一种大小为46kda的ii型跨膜糖蛋白。它的配体为cd31，也称为pecam-1。除了在内皮细胞上表达外，还在淋巴样细胞(卵泡膜b细胞和浆细胞)、肺(肺泡管、肺泡和淋巴管)和肾脏(肾小球细胞)中表达。通常，cd38 在正常淋巴样细胞和髓样细胞上低水平表达，但在浆细胞(也称效应b细胞)中的 cd38表达水平特别高。
7、cd38与配体cd31相互作用，在调节细胞迁移、受体介导的粘附以及信号传导中扮演着重要角色。此外，cd38蛋白质还是一种双功能胞外酶，兼具环化酶和水解酶的活性，参与核苷酸代谢。
8、cd38的表达与多种疾病有关，包括艾滋病、自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮)、2型糖尿病、骨质疏松症和癌症。研究发现，cd38在大量恶性血液癌症中高度表达，特别是在多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(all)、急性b淋巴细胞白血病(b-all)等癌症中，这使cd38成为多发性骨髓瘤治疗性抗体药物的开发靶点，目前国内外有多家药企正在开发。
9、强生的达雷妥尤单抗(daratumumab)是全球首个获批上市的人源化抗cd38 单抗赛诺菲(sanofi)的sarclisa是第2款获fda批准的cd38抗体药物。目前，中国仅有强生的达雷妥尤单抗一款cd38单抗于2021年获批上市，用于治疗mm 效果显著。目前以cd38为靶点的在研药物多为单克隆抗体，尚未有抗cd38 car- t上市产品。
10、3.抗cd38 car-t技术的开发
11、car-t疗法,即嵌合抗原受体t细胞免疫疗法,通过基因工程技术在t细胞表面表达包括scfv单链抗体、共刺激域等元件的嵌合抗原受体(car)，使其能够识别特定肿瘤抗原，用于治疗恶性血液癌症已取得良好疗效，包括急性b淋巴细胞白血病、大b细胞非霍奇金淋巴瘤和复发难治的cd19阳性恶性淋巴瘤等。car 结构是将抗体中可以直接识别肿瘤抗原的单链可变区域scfv(抗原受体)、共刺激信号都嵌合到t细胞的激活信号通路cd3ζ链上。cd38抗原在大多数aml和骨髓瘤细胞上表达，且在造血干细胞(hsc)上几乎不表达，使其成为car-t疗法治疗血液肿瘤疾病患者的潜在靶点。传统的car-t细胞的构建，把抗体重链可变区(vh) 和轻链可变区(vl)基因通过柔性linker(比如(g4s)3)连接成为scfv(单链可变片段)，再根据序列构建相应的car目标质粒，并联合病毒包装系统生产病毒然后用其转染t细胞制备相应靶点的car-t细胞，从而把scfv段表达t细胞表面，行使抗体靶向肿瘤抗原的功能。但由于传统的scfv形式分子量较大，空间位阻大，不稳定，不易通过慢病毒转导成功，因此作为scfv(传统vh与vl串联)的替代方案，纳米抗体vhh因体积小、分子量小、免疫原性低、稳定性好、抗原识别能力强和穿透力强等优点，而被广泛用作car-t的抗原结合结构域。然而，联合纳米抗体制备car-t细胞在噬菌体文库构建方面有所不同。
12、4.与本专利技术创造相关的现有技术及缺点
13、抗体基因工程技术在不断发展，如噬菌体展示技术为抗体的大量、快速生产提供了技术手段。噬菌体展示是一种新兴的表达技术，是在1990年建立和发展起来的，将外源抗体片段与噬菌体的衣壳蛋白融合，从而将其展示在噬菌体表面，筛选特异性抗原的抗体,通过原核或者真核细胞表达可以大规模生产抗体，此法操作简单且生产成本低。用抗原免疫骆驼后，使用噬菌体展示技术筛选相应的纳米抗体是非常高效和快速的方法，免疫骆驼后，采集骆驼血液，分离淋巴细胞，提取总rna，进行逆转录即可获得cdna，将其亚克隆至噬菌粒载体中与辅助噬菌体m13k07联用，用于制备单价纳米抗体展示库。构建的纳米抗体文库的大小及多样性是获得高亲和力纳米抗体的前提，还有，新鲜血液的采集和mrna及cdna的制备是构建高质量文库的关键。
14、噬菌体展示技术是抗体筛选的首选方法，因为该技术成熟且稳定,适合抗体的大规模生产。除了噬菌体展示技术外，其他的相关技术也成功应用到抗体生产中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种驼源重链抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
2.根据权利要求1所述的驼源重链抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段是VHH抗体；所述VHH抗体的氨基酸序列选自：
3.核酸，其特征在于，编码根据权利要求1或2所述的驼源重链抗体或抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，包含：
5.载体，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸。
6.宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸或者根据权利要求5所述的载体。
7.用于产生驼源重链抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，培养根据权利要求6所述的宿主细胞并从培养物回收所述驼源重链抗体或抗原结合片段。
8.一种抗CD38 CAR，其特征在于，包含抗CD38纳米抗体；所述抗CD38纳米抗体为根据权利要求1或2所述的抗原结合片段。
9.抗CD38 CAR-T或抗CD38 CAR-NK或抗CD38 CAR-M，其特征在于，其上修饰有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为根据权利要求8所述的抗CD38 CAR
10.根据权利要1或2所述的驼源重链抗体或抗原结合片段，或根据权利要求3所述的核酸，或根据权利要求5所述的载体，或根据权利要求6所述的宿主细胞，或根据权利要求8所述的抗CD38 CAR，或根据权利要求9所述的抗CD38 CAR-T或抗CD38 CAR-NK或抗CD38 CAR-M在制备抗肿瘤药物或治疗B细胞衍生的自身免疫性疾病药物中的应用。
11.根据权利要1或2所述的结合CD38的驼源抗体或CD38抗原结合片段在降低CD38的细胞表面表达水平或降低CD38的细胞内表达水平方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种驼源重链抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
2.根据权利要求1所述的驼源重链抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段是vhh抗体；所述vhh抗体的氨基酸序列选自：
3.核酸，其特征在于，编码根据权利要求1或2所述的驼源重链抗体或抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，包含：
5.载体，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸。
6.宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求3或4所述的核酸或者根据权利要求5所述的载体。
7.用于产生驼源重链抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，培养根据权利要求6所述的宿主细胞并从培养物回收所述驼源重链抗体或抗原结合片段。
8.一种抗cd38 car，其特征在于，包含抗cd38纳米抗体；所述抗c...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱红佳，徐南，谭靖雯，李明昊，康立清，余宙，
申请(专利权)人：上海优卡迪生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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