【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及一种紧凑型crispr/cas系统及其应用。
技术介绍
1、crispr/cas系统作为一种适应性免疫系统，在大约50％的细菌物种和几乎所有的古生菌物种中均有发现。根据cas蛋白的类型、序列相似性和crispr基因座的结构，研究人员将crispr/cas系统分为class1和class2两大类，六种类型(typei～typevi)，其中typei、typeiii、typeiv属于class1，typeii、typev、typevi属于class2。class1占crispr/cas系统的90％，主要存在于细菌和古生菌中，一般由4～7个cas蛋白亚基组成。因其组成成分较为复杂，不利于基因组编辑工具的开发和应用。class2只占crispr/cas系统的10％，通常具有一个多结构域的cas蛋白，用于靶位点的切割。现有的绝大多数crispr/cas基因编辑工具都是基于class2开发。
2、在crispr/cas带来的第一波基因编辑革命浪潮中，人们将目光主要聚焦在属于第2类，ii型cas9系统。而属于第2类，v型系统的cas12系统因为更广泛的pam识别范围和独特的dna编辑活性，吸引了人们目光。cas12系统可以拓展基因编辑工具箱。也正因cas12的特性，使其在进行相关技术开发和应用的过程中相较于cas9有所区别。以crispr/cas12a(cpf1)系统为例，其crrna骨架位于靶序列的5’端，因此普遍用在cas9系统中成熟sgrna的策略在cas12系统中不再适用
3、无论是cas9还是cas12a，都因其较大的蛋白体积，限制了其向细胞内的递送，从而阻碍了高效精简递送系统的开发。为了提高crispr/cas系统的递送效率并拓宽其应用范围，对更小分子量的crispr/cas基因编辑工具开发的需求应运而生。现已报道的可以用于dna双链编辑的紧凑型crispr/cas系统有两种：cas12f(cas14)和cas12j(casφ)，两者都属于class2的typev家族，cas12f和cas12j在蛋白体积上相较于我们熟知的cas9和cas12a有着显著的优势，与cas9或cas12a的1000～1700个氨基酸体积相比，这类紧凑crispr/cas系统中cas蛋白往往由400～700个氨基酸组成。
4、但是超紧凑型的cas12f在植物中的基因组编辑特性尚未见报道，而cas12j在拟南芥原生质体中的编辑活性<1％，极低的编辑活性限制了紧凑型crispr/cas系统在植物基因组编辑中的广适性。类似于cas12a，cas12f和cas12j靶向切割双链dna并产生粘性末端，有利于同源重组介导的精准基因编辑技术的开发，cas12j无需tracrna就可以加工成熟crrna的特性有助于多基因编辑工具的开发，其同源蛋白cas12j2识别5’-tbn-3’pams，可以作为一种天然的宽pam变体，相比cas9的pam变体可以有效避免self-targeting。
5、因此，cas12f和cas12j具有很大的开发潜力。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的上述技术问题，本申请针对cas12j系统中的同源蛋白cas12j2，优化相关载体的组装方式和crrna二级结构，提升cas12j2系统在水稻中的整体编辑效率。
2、本专利技术技术方案如下：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种紧凑型crispr/cas系统，所述系统包括以下单元：
4、(1)ph-cas12j-u3crrna：依次设置的水稻osu3启动子(genbank:mw145140.1)、pre-crrna、spacer、crrna、sup4ter、玉米ubi1启动子、cas12j、连接序列(l)、核定位信号(bpnls)、豌豆rbcs-e9终止子(genbank:x00806.1)；
5、或(2)ph-cas12j-trna：依次设置的柳枝稷ubi1启动子(即pvubip，genbank:hm209467.1)、trna核酶序列(hh，hammerhead锤头核酶)、crrna、间隔区spacer、trna核酶序列(丁型肝炎病毒核酶hdv核酶，hdv，genbank:mn555455.1)、花椰菜花叶病毒camv终止子(camv，genbank:kj716236.1)、ubipro、cas12j、连接序列(l)、核定位信号(bpnls)、豌豆rbcs-e9终止子(e9ter，genbank:x00806.1)；
6、或(3)ph-cas12j-stu：依次设置的玉米ubi启动子、cas12j、连接序列(l)、核定位信号(bpnls)、polya、pre-crrna、间隔区spacer、crrna、豌豆rbcs-e9终止子(e9ter，genbank:x00806.1)；
7、或(4)ph-cas12j-csy4：依次设置的黄叶卷曲病毒强启动子cmylcvpro、crrna、间隔区spacer、花椰菜花叶病毒35s终止子(35ster)、玉米ubi1启动子、csy4、p2a、cas12j、连接序列(l)、核定位信号(bpnls)、豌豆rbcs-e9终止子(e9ter，genbank:x00806.1)；所述crrna-bsai内切酶的识别位点两侧设置csy4识别位点。
8、进一步的，所述系统包括单元(3)。
9、进一步的，所述系统的基础载体为pcambia1300载体。
10、进一步的，所述系统插入位点为paci酶切位点。
11、进一步的，所述cas12j选自cas12j1、cas12j2、cas12j3、cas12j4、cas12j5、cas12j7、cas12j8、cas12j9中的一种或多种。
12、优选的，所述单元(1)、(3)和(4)中的cas12j选自cas12j2或cas12j8；所述单元(2)中的cas12j选自cas12j1、cas12j2、cas12j3、cas12j4、cas12j5、cas12j7、cas12j8、cas12j9中的一种或多种。
13、进一步的，所述单元(1)、(3)和(4)中的cas12j选自cas12j2。
14、所述cas12j1的氨基酸序列如seq id no.5所示、cas12j2的氨基酸序列如seq idno.6所示、cas12j3的氨基酸序列如seq id no.7所示、cas12j4的氨基酸序列如seq idno.8所示、cas12j5的氨基酸序列如seq id no.9所示、cas12j7的氨基酸序列如seq idno.10所示、cas12j8的氨基酸序列如seq id no.11所示、cas12j9的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述系统包括以下单元：
2.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述系统的基础载体为pCAMBIA1300载体。
3.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述系统插入位点为基础载体的PacI酶切位点。
4.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述Cas12j选自Cas12j1、Cas12j2、Cas12j3、Cas12j4、Cas12j5、Cas12j7、Cas12j8、Cas12j9中的一种或多种；
5.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述crRNA长度为15nt～25nt，优选的，所述crRNA长度为25nt。
6.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述单元(3)的间隔区Spacer长度为18nt。
7.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述crRNA的茎环上4个碱基选自ATAG、
8.根据权利要求1所述的紧凑型CRISPR/Cas系统，其特征在于，编码所述单元(1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述单元(2)的核苷酸序列如由5’端到3’端依次连接的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.21所示；编码所述单元(3)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述单元(4)的核苷酸序列如由5’端到3’端依次连接的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.22所示。
9.权利要求1至8任一项所述的紧凑型CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在植物中进行基因编辑中的应用；优选的，所述植物为双子叶或单子叶植物；进一步优选的，所述植物为水稻。
...【技术特征摘要】
1.一种紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述系统包括以下单元：
2.根据权利要求1所述的紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述系统的基础载体为pcambia1300载体。
3.根据权利要求1所述的紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述系统插入位点为基础载体的paci酶切位点。
4.根据权利要求1所述的紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述cas12j选自cas12j1、cas12j2、cas12j3、cas12j4、cas12j5、cas12j7、cas12j8、cas12j9中的一种或多种；
5.根据权利要求1所述的紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述crrna长度为15nt～25nt，优选的，所述crrna长度为25nt。
6.根据权利要求1所述的紧凑型crispr/cas系统，其特征在于，所述单元(3)的间隔区spacer长度为18nt。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：万建民，李超，孙岩，胡健健，明子恒，单调风，刘裕强，何俊，刘喜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。