【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域。
技术介绍
1、i型nkt细胞(nkt)是先天淋巴细胞的进化保守亚群，其表达恒定tcrα链vα24-jαl8，并对单形hla i类分子cd1d(基因id 912)呈递的自体或微生物衍生的糖脂起反应(porcelli等人analysis of t cell antigen receptor(tcr)expression by humanperipheral blood cd4-8-alpha/beta t cells demonstrates preferential use ofseveral v beta genes and an invariant tcr alpha chain.j.exp.med.1993；178(1):1-16；lantz和bendelac,“an invariant t cell receptor alpha chain is used by aunique subset of major histocompatibility complex class i-specific cd4+andcd4-8-t cells in mice and humans,”j.exp.med.1994；180(3):1097-1106；bendelac a,lantz o,quimby me,yewdell jw,bennink jr,brutkiewicz rr.cd1 recognition bymouse nk1+t lymphocytes.science
2、全球转录组分析研究证明nkt尽管与t细胞和nk细胞共享特性，但它们是独特的淋巴细胞群(cohen等人,2013)。在小鼠和人类中，nkt与处于cd4+cd8+(双阳性，dp)胸腺细胞(cd8，基因id 925)阶段的常规t细胞不同。与被胸腺上皮细胞阳性选择的常规t细胞不同，nkt被表达cd1d的dp胸腺细胞选择(gapin l,matsuda jl,surh cd,kronenberg m.nktcells derive from double-positive thymocytes that are positively selected bycdld.nat.lmmunol.2001；2(10):971-978)。早幼粒细胞白血病锌指转录因子(plzf)在阳性选择后立即表达使得能够进行nkt的胸腺内扩增和效应/记忆样分化(savage ak,等人thetranscription factor plzf directs the effector program of the nkt celllineage.immunity.2008；29(3):391-403)。
3、nkt细胞具有多种抗肿瘤特性，并且据报道，nkt细胞的数量与多种癌症类型的良好预后相关。heczey a.等人和tian g.等人证明nkt细胞可从外周血中分离出来，用car转导，并扩展到临床规模以用于过继性细胞疗法应用。多项研究表明，供体衍生的nkt不会介导gvhd并且甚至可能会抑制gvhd。因此，同种异体健康供体衍生的car-nkt细胞可用于治疗癌症患者而不存在gvhd风险，与t细胞相反，不需要额外的基因操作。
4、然而，所有正常有核细胞都表达hla i类，并且因此来自hla不匹配供体的过继转移治疗细胞将被宿主免疫系统消除。t细胞和nkt细胞在激活时也可瞬时表达hla ii类，并且hla ii类不匹配会触发宿主cd4 t细胞的供体细胞消除。延迟此类排斥的常见方法是使用免疫抑制宿主调节，以允许用于效应细胞在宿主免疫系统恢复之前介导抗肿瘤活性的治疗窗口。然而，此类方法对患者有毒，并且由于治疗效应细胞的持久性不足，可能不允许完全肿瘤控制。
5、因此，需要现成的可快速扩展到临床规模，不会诱发移植物抗宿主病(gvhd)并且患者耐受的基于car的细胞免疫疗法。由于单形cd1d的限制，nkt细胞不产生gvhd。
6、为了限制同种异体宿主的免疫系统对car-nkt细胞的排斥，本公开提供了掺入针对β2-微球蛋白(b2m)和恒定链(ii)(也称为cd74)或ii类反式激活因子(ciita)的shrna序列以在nkt细胞中分别实现hla i类和ii类的敲低的构建体。特别地，本公开提供了包含在整合到car构建体中的人工微rna(amir)支架内嵌入的shrna序列的构建体。
7、此处表明优化的car-amir构建体介导转导的nkt细胞中hla i类和ii类的有效敲低。表达这些构建体的nkt细胞证明了在淋巴瘤nsg小鼠模型中有效的体内抗肿瘤活性，以及在体外和体内均抵抗同种异体免疫细胞的排斥。
技术实现思路
1、本公开提供并包括用于抑制内源主要组织相容性复合体(mhc)基因的表达的重组构建体，其包含编码识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)的dna序列和编码靶向mhc i类或mhc ii类基因的小发夹rna (shrna)序列的dna序列，其中shrna序列嵌入人工微rna(amir)支架中。
2、在一个方面，本文公开的重组构建体进一步包含编码细胞因子的dna序列。在一些方面，细胞因子是白细胞介素-15(il-15)、il-7、il-12、il-18、il-21、il-27、il-33或其组合。在一个方面，细胞因子是il-15。在一个方面，il-15是人il-15。在一个方面，编码il-15的dna序列是密码子优化的。在另一个方面，il15包含il-2信号肽。
3、在一些方面，amir是amir155。在其他方面，amir是amir30。
4、在一些方面，mhc i类基因编码β2-微球蛋白(b2m)。
5、在一些方面，mhc ii类基因编码恒定链(ii)或ii类反式激活因子(ciita)。
6、在一些方面，本文公开的重组构建体包含嵌入第一amir支架中的第一shrna序列和嵌入第二amir支架中的第二shrna序列。在一些方面，第一shrna序列靶向mhc i类基因并且第二shrna序列靶向mhc i类基因。在一个方面，第一amir支架和第二amir支架来自相同的amir序列。在其他方面，第一amir支架和第二amir支架来自不同的amir序列。
7、本公开还提供并包括用于限制同种异体宿主的免疫系统对工程化自然杀伤t(nkt)细胞的排斥的方法，其包括用本文公开的重组构建体转导nkt细胞，其中nkt细胞中的内源mhc基因的表达被shrna抑制。
8、在一些方面，内源mhc基因的表达水平在转导后2天降低至少1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于抑制内源主要组织相容性复合体(MHC)基因的表达的重组构建体，其包含编码识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的DNA序列和编码靶向MHC I类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中所述shRNA序列嵌入人工微RNA(amiR)支架中。
2.根据权利要求1所述的重组构建体，其中所述肿瘤抗原为CD19、GD2或GPC3。
3.根据权利要求1或2所述的重组构建体，其进一步包含编码细胞因子的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的重组构建体，其中所述细胞因子为白细胞介素-15(IL-15)、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、IL-33或其组合。
5.根据权利要求4所述的重组构建体，其中所述细胞因子为IL-15。
6.根据权利要求5所述的重组构建体，其中编码IL-15的DNA序列为密码子优化的。
7.根据权利要求5或6所述的重组构建体，其中所述IL-15包含IL-2信号肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组构建体，其中所述amiR为a
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组构建体，其中所述shRNA序列的长度为至少21个核苷酸并且包含与MHC基因序列的至少21个连续核苷酸相同或互补的核苷酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组构建体，其中所述MHC I类基因编码β2-微球蛋白(B2M)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组构建体，其中所述MHC II类基因编码恒定链(Ii)或II类反式激活因子(CIITA)。
12.根据权利要求1至11所述的重组构建体，其中所述构建体包含嵌入第一amiR支架中的第一shRNA序列和嵌入第二amiR支架中的第二shRNA序列。
13.根据权利要求12所述的重组构建体，其中所述第一shRNA序列靶向MHC I类基因并且所述第二shRNA序列靶向MHC I类基因。
14.根据权利要求12所述的重组构建体，其中所述第一amiR支架和所述第二amiR支架来自相同的amiR序列。
15.根据权利要求12所述的重组构建体，其中所述第一amiR支架和所述第二amiR支架来自不同的amiR序列。
16.一种用于限制同种异体宿主的免疫系统对工程化自然杀伤T(NKT)细胞的排斥的方法，其包括用根据权利要求1至15中任一项所述的重组构建体转导NKT细胞，其中所述NKT细胞中的所述内源MHC基因的所述表达被所述shRNA抑制。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述内源MHC基因的表达水平在转导后2天降低至少10％。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述内源MHC基因的表达水平在转导后7天降低至少10％。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述内源MHC基因的表达水平在转导后14天降低至少10％。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述NKT细胞为CD1d限制性NKT细胞。
21.一种工程化NKT细胞，其用根据权利要求1至15中任一项所述的重组构建体转导，其中与未用所述重组构建体转导的对照NKT细胞相比，所述NKT细胞中的所述内源MHC基因的所述表达被显著抑制。
22.根据权利要求21所述的工程化NKT细胞，其中所述工程化NKT细胞具有改善的对同种异体T细胞或PBMC的排斥的抗性。
23.根据权利要求21所述的工程化NKT细胞，其中所述工程化NKT细胞具有改善的对同种异体自然杀伤细胞的破坏的抗性。
24.根据权利要求21所述的工程化NKT细胞，其中所述工程化NKT细胞表现出体内抗肿瘤活性。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于抑制内源主要组织相容性复合体(mhc)基因的表达的重组构建体，其包含编码识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)的dna序列和编码靶向mhc i类或mhc ii类基因的小发夹rna(shrna)序列的dna序列，其中所述shrna序列嵌入人工微rna(amir)支架中。
2.根据权利要求1所述的重组构建体，其中所述肿瘤抗原为cd19、gd2或gpc3。
3.根据权利要求1或2所述的重组构建体，其进一步包含编码细胞因子的dna序列。
4.根据权利要求3所述的重组构建体，其中所述细胞因子为白细胞介素-15(il-15)、il-7、il-12、il-18、il-21、il-27、il-33或其组合。
5.根据权利要求4所述的重组构建体，其中所述细胞因子为il-15。
6.根据权利要求5所述的重组构建体，其中编码il-15的dna序列为密码子优化的。
7.根据权利要求5或6所述的重组构建体，其中所述il-15包含il-2信号肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组构建体，其中所述amir为amir155或amir30。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组构建体，其中所述shrna序列的长度为至少21个核苷酸并且包含与mhc基因序列的至少21个连续核苷酸相同或互补的核苷酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组构建体，其中所述mhc i类基因编码β2-微球蛋白(b2m)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组构建体，其中所述mhc ii类基因编码恒定链(ii)或ii类反式激活因子(ciita)。
12.根据权利要求1至11所述的重组构建体，其中所述构建体包含嵌入第一amir支架中的第一shrna序列和嵌入第二amir支架中的第二shrna序列。
...【专利技术属性】
技术研发人员：A·海茨伊，刘斌，L·S·梅特里萨，
申请(专利权)人：贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：
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