【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种靶向人源cd7的单域抗体和含有该单域抗体的cd7-car-t细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的一个最重要的手段，只有在识别癌细胞后，免疫系统才能够有效的进攻癌细胞，癌变是正常体细胞失去正常细胞调节功能，基因突变累计到一定程度的结果，但是，癌细胞能够把自己伪装成正常体细胞，巧妙的避开免疫系统的攻击。
2、肿瘤相关抗原(taa)，指的是自身抗原由肿瘤细胞表达，其在正常宿主细胞中部分存在，主要来源于基因扩增或者翻译后修饰，但是倾向于在肿瘤细胞中高表达或特异性表达。目前有许多肿瘤相关抗原及肿瘤特异性抗原被发现，以taa为目标的靶向治疗是癌症治疗的重要途径。市场上已经有许多依赖此机制的癌症免疫治疗药物，它们在临床上具有很好的疗效。
3、一般来说，通过抗体介导的taa识别可以巧妙地引导nk细胞或者t细胞靶向对应的taa高表达肿瘤细胞。而针对taa的抗体(例如，利妥昔单抗和曲妥珠单抗)不仅可以通过adcc效应直接杀死肿瘤细胞，也可以作为诊断标记物或者创新性的增加传统癌症疗法的靶向性。
4、过继性免疫治疗是血液学的一种变革性治疗方法，它通过基因工程在t细胞表达合成嵌合抗原受体(car)。car是工程化受体，可将免疫细胞重定向至靶向癌细胞。car-t细胞在血液系统恶性肿瘤患者中取得了令人瞩目的成果，fda批准了6种car-t细胞用于治疗复发性或难治性b细胞恶性肿瘤：abecma、breyanzi、carvykti、kymr
5、cd7是一种免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。它以同型二聚体形式存在于大多数成熟外周血t细胞、所有胸腺细胞和自然杀伤(nk)细胞的细胞表面，也在骨髓细胞系和产生未成熟祖细胞的t/b细胞上表达。cd7是t细胞成熟过程中的首要标志物之一。因此，它被用作检测原发性t细胞癌的诊断标志物。cd7在急性t细胞白血病(t-all)和外周t细胞淋巴瘤亚群中高度表达。而cd7的正常表达主要局限于t细胞和自然杀伤(nk)细胞，从而降低了脱靶器官毒性的风险。cd7由于其内化效果在部分临床研究中作为t细胞恶性肿瘤患者免疫毒素抗体的靶标，尽管没有严重的cd7抗体相关永久性不良反应，但肿瘤反应有限。因此，可通过用自体car-t细胞替代单克隆抗体来增强cd7定向细胞毒性的效力，将增强cd7靶向治疗在t细胞恶性肿瘤患者中的疗效。(gomes-silva d,srinivasan m,sharma s,lee cm,wagner dl,davis th,et al.cd7-edited t cells expressing a cd7-specific car forthe therapy of t-cell malignancies.blood.2017；130(3):285–296；sempowski gd,leedm,kaufman re,haynes bf.structure and function of the cd7 molecule.crit revimmunol.1999；19(4):331–348；safarzadeh kozani p,safarzadeh kozani p,rahbarizadeh f.car-t cell therapy in t-cell malignancies:is success a low-hanging fruit？stem cell res ther.2021oct 7；12(1):527)。
6、相较于b-all的car-t治疗，应用cd7-car-t细胞靶向治疗t细胞急性淋巴细胞白血病和cd7阳性的淋巴瘤等依然面临着很大的技术问题，这是因为正常的效应t细胞和t细胞肿瘤都表达cd7抗原，而会导致cd7-car-t细胞的“自相残杀”效应，现有技术体外制备cd7-car-t细胞常常因为存在“自杀”效应，而很难在体外制备成功。因此，需要开发一种新的cd7抗体或其抗原片段，阻断t细胞上的cd7表达，并表达在cd7-car-t细胞上，使得cd7-car-t制备过程不会自杀，而可以在体外正常扩增，并对cd7阳性靶细胞具有杀伤力。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的技术问题，本专利技术人通过深入研究，制备、挑选了特有的抗人cd7的单域抗体序列。利用cdr嫁接技术将阳性单域抗体的cdrs嫁接到人类天然种系序列中，经过组合设计获得人源化抗体重链可变区dna片段，作为本专利技术cd7-car-t构建的抗原识别元件，同时，构建了一种有效阻断t细胞表面cd7分子表达的cd7载体，从而消除cd7-car-t细胞的“自相残杀”效应，以利于cd7-car-t细胞的体外制备和生产。本专利技术提供的靶向人源cd7的单域抗体构建的cd7-car-t细胞对靶细胞jurkat/luc的体外杀伤效果要优于阳性参照vhh6 car-t细胞。具体地，本专利技术包括以下内容。
2、第一方面，本专利技术提供一种特异性结合cd7抗原的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含互补决定区1(cdr 1)，互补决定区2(cdr2)和互补决定区3(cdr3),其中：
3、cdr1包含seq id no:18所示序列，cdr2包含seq id no:19所示序列，cdr3包含seqid no:20所示序列；
4、cdr1包含seq id no:42所示序列，cdr2包含seq id no:43所示序列，cdr3包含seqid no:44所示序列；
5、cdr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性结合人源CD7的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3,其中，
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述CDR区序列选择以下任一组：
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括羊驼抗体或人抗体的框架区。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自全抗体、Fab,Fab’，Fv片段，scFv,di-scFv和单域抗体组成的组；优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单域抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、Fc融合抗体或人源化抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段包括：SEQ ID NO:17、41、1、5、9、13、21、25、29、33、37、45和49-51中任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80％一致性的突变体氨基酸序列。
7.一
8.根据权利要求7所述的CD7阻断分子，其特征在于，所述CD7阻断分子包括两个相同的单域抗体，所述单域抗体之间通过连接子连接。
9.根据权利要求7所述的阻断分子，其特征在于，所述内质网定位结构域的序列包括SEQ ID NO:63所示序列。
10.根据权利要求7所述的CD7阻断分子，其特征在于，还包括信号肽序列；优选地，所述信号肽序列包括SEQ ID NO:53所示序列。
11.根据权利要求7所述的CD7阻断分子，其特征在于，所述CD7阻断分子氨基酸序列包含SEQ ID NO:52所示序列或与其具有至少80％一致性的突变体序列。
12.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包括胞内共刺激信号结构域。
14.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体序列包含SEQ ID NO:59-61中任一项所示的氨基酸序列。
15.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求7-11任一项所述的阻断分子，或权利要求12-14任一项所述的嵌合抗原受体。
16.一种载体，其包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的载体。
18.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞中含有权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求7-11任一项所述的阻断分子，或根据权利要求12-14任一项所述的嵌合抗原受体。
19.根据权利要求18所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达权利要求12-14任一项所述的嵌合抗原受体。
20.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求7-11任一项所述的阻断分子，或权利要求12-14任一项所述的嵌合抗原受体，或权利要求18或19所述的工程化免疫细胞，和/或药学上可接受的载剂。
21.一种根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求7-11任一项所述的阻断分子，或根据权利要求18或19所述的工程化免疫细胞或根据权利要求20所述的组合物在治疗肿瘤或癌症的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述癌症或肿瘤是血液系统恶性肿瘤；优选地，所述血液系统恶性肿瘤为T细胞相关肿瘤。
23.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种特异性结合人源cd7的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链可变区，所述重链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3,其中，
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述cdr区序列选择以下任一组：
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括羊驼抗体或人抗体的框架区。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自全抗体、fab,fab’，fv片段，scfv,di-scfv和单域抗体组成的组；优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单域抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、fc融合抗体或人源化抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段包括：seq id no:17、41、1、5、9、13、21、25、29、33、37、45和49-51中任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80％一致性的突变体氨基酸序列。
7.一种cd7阻断分子，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段和内质网定位结构域，所述阻断分子能够降低cd7分子在细胞表面的表达。
8.根据权利要求7所述的cd7阻断分子，其特征在于，所述cd7阻断分子包括两个相同的单域抗体，所述单域抗体之间通过连接子连接。
9.根据权利要求7所述的阻断分子，其特征在于，所述内质网定位结构域的序列包括seq id no:63所示序列。
10.根据权利要求7所述的cd7阻断分子，其特征在于，还包括信号肽序列；优选地，所述信号肽序列包括seq id no:53所示序列。
11.根据权利要求7所述的cd7阻断分子，其特征在于，所述cd7阻断分子氨基酸序列包含seq id no:52所示序列或与其具有至少...
【专利技术属性】
技术研发人员：李应宇，辛阳，李恋曲，祁增，贾文双，周艺，陈黎，梁雨，
申请(专利权)人：南京蓬勃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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