【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及一种用于定量检测rna融合的组合物及检测方法。
技术介绍
1、基因融合(gene fusion)是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子和终止子等)的控制之下，构成嵌合基因。有研究表明在多达17％的实体瘤中鉴定出至少一种基因融合体，基因融合会导致激酶持续性激活从而引发癌症。根据cosmic及tcga数据库分析，肿瘤中最常见的融合基因为ret，alk，ros1和ntrk3等基因，以ret基因为例，常以本身断裂再与另一基因接合的方式，导致含有激酶结构域编码区的3’端基因与多种异源上游伴侣基因(例如ccdc6、ncoa4和kif5b)的5’端发生融合，重组成一个新的基因(融合基因)。基因融合通常是由于染色体重排所造成的。异常基因融合事件与肿瘤的发生发展有关，因此这些基因的改变是重要的诊断、预后和预测性生物标记物。
2、目前临床上基因融合检测常用的检测方法为rt-pcr法、二代测序法和数字pcr定量。rt-pcr法和二代测序法是采用ct值或阳性reads数确定样本中是否有融合，无法对融合进行定量；数字pcr通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行pcr扩增，并根据泊松分布和阳性比例计算核酸拷贝数实现定量分析。
3、在应用数字pcr检测融合rna时，需要将rna先逆转为cdna，常用的逆转录引物为oligo(dt)引物，随机引物及特异性引物。oligo(dt)作为反转录引物对rna质量要求高，若rna发生降解，无法全长合成，cdna合成
4、目前市场上已存在的应用数字pcr定量rna融合试剂盒，主要是针对rna融合中的拷贝数进行绝对定量，但在绝对定量过程中原始样本浓度(样本浓度过高容易出现所有微反应单元全阳信号，浓度过低出现所有微反应单元全阴信号，导致统计学公式计算误差而形成检测结果的不精确)、样本总体积、数字pcr的分区方式(分区方式主要为固相物理分割和“油包水”的液滴分区两种。泊松分布计算准确的前提是需要保证每个微反应单元体积大小一致。然而，“油包水”液滴生成的过程中，每个液滴的体积大小无法保证完全相同)、样本反应液总有效分区数(即是指最终生成含有反应液的可被计算到最终统计学公式中的微反应单元数)这些因素均会对数字pcr的定量准确性产生影响，导致数字pcr具有较高的偏差，且重复性不好，不利于对融合阳性样本的准确判读，故无法对rna融合进行精准定量，因此，急需开发一种准确定量rna融合的方法，克服上述问题。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于定量检测rna融合的组合物及检测方法，用于解决现有技术中的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种用于定量检测rna融合的组合物，所述组合物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于检测融合rna，所述第二引物对用于检测与所述融合rna相对应的野生型rna，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，以融合rna的融合位点为标志，所述第一上游引物与融合rna中融合位点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第一下游引物与融合rna中融合位点后的外显子的编码核苷酸互补，所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，野生型rna上与融合rna的融合位点对应的位置称为断裂点，以断裂点为标志，所述第二上游引物与野生型rna中断裂点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第二下游引物与野生型rna中断裂点后的外显子的编码核苷酸互补，所述第一引物对和第二引物对的扩增效率相差10％以内。
3、本专利技术还提供所述组合物在制备定量检测rna融合产品中的用途。
4、本专利技术还提供一种用于定量检测rna融合的试剂盒，所述试剂盒包括前述组合物。
5、本专利技术还提供一种定量检测rna融合的方法，所述方法包括如下步骤：
6、1)将待测rna样本逆转录为cdna；
7、2)利用步骤1)获得的cdna和所述组合物中的第一引物对、第二引物对以及探针进行数字pcr扩增获得pcr产物；
8、3)对步骤2)获得的pcr产物进行荧光信号分析，计算获得rna融合的比例。
9、本专利技术还提供一种用于设计所述组合物的装置，所述装置包括：
10、1)目标序列提供模块，用于提供融合rna和野生型rna的编码核苷酸序列、以及融合rna的融合位点和野生型rna的断裂点；
11、2)引物生成模块，用于生成第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于检测融合rna，所述第二引物对用于检测与所述融合rna相对应的野生型rna，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物与融合rna中融合位点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第一下游引物与融合rna中融合位点后的外显子的编码核苷酸互补，所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物；所述第二上游引物与野生型rna中断裂点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第二下游引物与野生型rna中断裂点后的外显子的编码核苷酸互补。
12、如上所述，本专利技术的用于定量检测rna融合的组合物及检测方法，具有以下有益效果：rna融合定量误差小，重复性好，测量数值稳定性高，而且可以适用各种类型的逆转录引物。
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1.一种用于定量检测RNA融合的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于检测融合RNA，所述第二引物对用于检测与所述融合RNA相对应的野生型RNA，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物与融合RNA中融合位点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第一下游引物与融合RNA中融合位点后的外显子的编码核苷酸互补；所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物与野生型RNA中断裂点前的外显子的编码核苷酸互补，所述第二下游引物与野生型RNA中断裂点后的外显子的编码核苷酸互补，所述第一引物对和第二引物对的扩增效率相差10％以内。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一引物对或第二引物对为用于数字PCR的扩增引物；和/或，所述融合RNA中融合位点前或融合位点后的外显子均为与融合位点相邻的外显子。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一上游引物和第一下游引物距离融合位点50～200bp，和/或，所述第二上游引物和第二下游引物距离野生型RNA断裂点50～200bp。
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