本发明专利技术涉及一种检测ＳＬＣ２６Ａ４基因ｃ．２００６Ａ＞Ｔ突变的试剂盒，该试剂盒包括针对ＳＬＣ２６Ａ４基因或ＳＬＣ２６Ａ４基因编码区第２００６位碱基附近设计的ＰＣＲ引物、ＰＣＲ反应试剂和检测ＰＣＲ扩增产物的试剂。本发明专利技术具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，有效地判断来自于患者的待测样本中是否存在ＳＬＣ２６Ａ４基因ｃ．２００６Ａ＞Ｔ突变，从而为判断该患者前庭导水管扩大发生原因提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测基因突变的试剂盒，尤其涉及检测SLC26A4基因c. 2006A > T(p.D669V)突变的试剂盒。
技术介绍
SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且发现该基因突变可以导 致一种常染色体隐性遗传性疾病=Pendred综合征，临床表现为甲状腺肿，及合并前庭导水 管扩大或Mondini畸形(前庭导水管扩大合并耳蜗发育不全)的感音神经性耳聋。后来， Usami等对6例单纯前庭导水管扩大家系的SLC26A4基因的筛查结果表明，该基因的突变还 可以导致单纯前庭导水管扩大，其遗传模式也是隐性遗传。由此可见，SLC26A4基因突变可 以导致前庭导水管扩大——单纯性前庭导水管扩大或者是合并耳蜗畸形的前庭导水管扩 大。前庭导水管扩大是内耳最常见的畸形，其在遗传性耳聋中占到1 8%。临床上主要 表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为重度或者是极重度耳 聋，发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等使颅内压增高的诱因。与前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含21个外显子，开放 阅读框架2343bp，贯穿外显子2和外显子21。该基因编码的蛋白——Pendrin是一个分子 量为86kD，含780个氨基酸的跨膜蛋白，属于离子转运子家族。Scott和Bidart等的研究 发现，Pendrin主要表达于甲状腺滤泡细胞的顶膜及内淋巴管和内淋巴囊的主细胞，介导碘 离子和氯离子的转运，在维持甲状腺组织和内淋巴的离子平衡上发挥作用。在甲状腺，当 Pendrin功能障碍时，其不能把碘离子及时转运到滤泡胶质，使碘离子在滤泡细胞内积聚， 从而不能有效有机化并与甲状腺球蛋白结合，从而导致Pendred综合征中甲状腺肿的发 生。Qvortrup等认为，大鼠的内淋巴囊类似甲状腺滤泡，有平衡胶状物质填塞囊腔，内淋巴 囊主细胞的功能类似于甲状腺滤泡细胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白质。氯离子转运障 碍使内淋巴液的成分改变，从而损伤感觉上皮细胞，导致感音神经性耳聋，并且由于渗透压 改变和成分改变的毒性机制导致膜迷路结构改变。由于内淋巴管和内淋巴囊到4岁时才停 止发育，因此它们的扩大可以导致周围骨性结构的改变，例如前庭导水管或耳蜗结构的改 变。对于前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的筛查，国外已经广泛开展，报道的 致病突变位点超过200个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，分布于各 个外显子。SLC26A4基因具有明显的异质性，不同种族其突变形式不完全相同。该基因突变 后其编码的蛋白不能准确定位到细胞膜上，而是存在于内质网或者是高尔基体内，影响离 子转运。但目前尚无c.2006A>T突变的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种判定待测个体的样本是否存在SLC26A4 基因突变的检测SLC26A4基因c. 2006A > T突变的试剂盒。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供该试剂盒在检测前庭导水管扩大相关 的位于SLC26A4基因的2006位突变中的应用。为解决上述问题，本专利技术所述的一种检测SLC26A4基因c. 2006A > T突变的试剂 盒，包括——针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第2006位碱基附近设计的PCR引 物；——PCR反应试剂；——检测PCR扩增产物的试剂。所述PCR引物为15 30个碱基，GC含量为45 50%。 所述PCR引物中上游引物为SLC26A4-17F :5，-TCTTCGTTTAGAATGGCATCA-3，下游引物为SLC26A4-17R :5，-ATTGCCAAAGCTCCAAATGT-3，。所述PCR 反应试剂为 2. 5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 缓冲液，2. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP，0. 3μ 1、5υ/μ 1 的耐热聚合酶，0. 25 μ 1 荧光染料(Big-Dye mix)。所述检测PCR扩增产物的试剂为测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限 制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂或杂交探针检测试剂中的任意一种。如上所述的检测SLC26A4基因c. 2006A > T突变的试剂盒在检测前庭导水管扩大 相关的位于SLC26A4基因的2006位突变中的应用，包括以下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取基因组DNA ；(2)以所述DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物SLC26A4-17F :5，-TCTTCGTTTAGAATGGCATCA-3，SLC26A4-17R :5，-ATTGCCAAAGCTCCAAATGT-3，；(3)将所述PCR扩增产物纯化后进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4基因标准 序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 2006A > T突变位点；(4)判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c. 2006A > T导致的前庭导水管扩大。该应用还包括按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 2006A > T突变，使得位于 Pendrin羧基端的第669位氨基酸由天冬氨酸变为缬氨酸。本专利技术与现有技术相比具有以下优点1、由于本专利技术中设有针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第2006位碱基附 近设计的PCR引物，因此，利用该引物并配合PCR反应试剂和检测试剂，可有效地判断来自 于患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因c. 2006A > T突变，从而为判断该患者前庭导 水管扩大发生原因提供依据。2、由于本专利技术在实际应用时，以基因组DNA为模板，利用针对SLC26A4基因或 SLC26A4基因编码区第2006位碱基附近设计的PCR引物进行扩增、检测，因此，本专利技术具有 快速、灵敏度高、特异性强的特点。具体实施例方式检测SLC26A4基因c. 2006A > T突变的试剂盒，包括——针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第2006位碱基附近设计的PCR引物； ——PCR反应试剂； ——检测PCR扩增产物的试剂。 其中PCR引物依据已知的核苷酸序列设计为15 30个碱基，GC含量为45 50%。本 专利技术应用在线引物设计软件primer 3. 0设计了一对PCR引物，其序列为上游引物SLC26A4-17F :5，-TCTTCGTTTAGAATGGCATCA-3，(Nt41583_Nt41603)；下游引物SLC26A4-17R :5，-ATTGCCAAAGCTCCAAATGTA-3，(Nt41850_Nt41869)。PCR 反应试剂为 2·5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10 X PCR 缓冲液，2. 0 μ 1、2· 5mM 的 dNTP， 0. 3μ 1,5υ/μ 1 的耐热聚合酶，0. 25 μ 1 荧光染料(Big-Dye mix)。检测PCR扩增产物的试剂为测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性 长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂或杂交探针检测试剂中的任意一种。检测SLC26A4基因c. 2006A > T突变的试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测ＳＬＣ２６Ａ４基因ｃ．２００６Ａ＞Ｔ突变的试剂盒，包括－－针对ＳＬＣ２６Ａ４基因或ＳＬＣ２６Ａ４基因编码区第２００６位碱基附近设计的ＰＣＲ引物；－－ＰＣＲ反应试剂；－－检测ＰＣＲ扩增产物的试剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭玉芬，王艳莉，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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