【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵，尤其是涉及一种提高clostridiumljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法。
技术介绍
1、厌氧菌clostridium ljungdahlii是一种潜在的微生物工厂，被广泛研究用于合成生物学和代谢工程领域。它能够在没有氧气存在的条件下，利用合成气(含有co和h2的混合物)作为原料进行发酵，产生有价值的化合物，如乙醇、乙酸和其他生化产品；此外，这种细菌还可用于将有机废弃物转化为有价值的化合物，从而实现废物资源化利用、帮助减少碳排放。
2、厌氧菌clostridium ljungdahlii特点：这种细菌在缺氧环境下生长，因此在一些特殊的生产过程中很有用，比如废弃物处理和生物燃料生产；它具备独特的气体发酵能力，能够利用合成气作为碳源和能源，通过多步反应合成有机化合物。作为厌氧菌，clostridium ljungdahlii在合成气发酵以产生乙醇、乙酸等化合物方面具有非常大的潜力。
3、整体而言，当使用一氧化碳作为原料，通过合成气发酵产生乙醇时，化学反应式如下：6co+3h2o→c2h5oh+4co2，即六分子一氧化碳与三分子水反应生成乙醇。当使用一氧化碳作为原料，通过合成气发酵产生乙酸时，化学反应式为：4co+2h2o→ch3cooh+2co2，即四分子一氧化碳与两分子水反应生成乙酸。在这些反应中，合成气中的一氧化碳(co)与厌氧菌clostridium ljungdahlii在特定代谢途径下发生催化反应，产生乙酸和乙醇等有用的化合物。但需要注意的是，这
4、合成气厌氧发酵使用的代谢通路为乙酰辅酶a代谢通路(acetyl-coa pathway)，也叫wood-ljungdahl途径(wl途径)，详情见图1。在该途径中，合成气厌氧发酵通常利用acetyl-coa为中间代谢产物，通过不同的代谢途径合成乙酸和乙醇等化合物。这是一种复杂的代谢网络，涉及多个酶催化步骤。
5、其中，对于乙酸的合成，可能的代谢途径为：将一氧化碳和甲酸(formate)转化为acetyl-coa，然后通过后续反应合成乙酸。一氧化碳被氢化成甲酸，然后甲酸被氧化成co2，并将co2与氢合成乙酸。这是一种关键的代谢途径，涉及多个酶的协同作用。
6、对于乙醇的合成，可能的代谢途径有以下两种：(1)类似于乙酸合成，wl途径中产生的acetyl-coa先转化成乙酸，这过程生成一分子的atp，然后通过后续酶催化步骤把中间产物乙酸转化乙醛，然后转化为乙醇。(2)在某些情况下，乙醇的合成也可以通过acetyl-coa经过还原反应直接生成乙醛，然后生成乙醇。
7、需要注意的是，在以上两种不同的乙醇生产过程中，存在不同的atp平衡及能量平衡。在途径(1)中，伴随着每一个乙酸分子的生成，系统会产生一个额外的atp；而在途径(2)中，乙醇的生成不会产生额外的atp。而该发酵菌株clostridium ljungdahlii的细胞生长浓度(cell biomass)却和atp的多寡息息相关。因此，可预见的是，因为过程中不同比例乙酸、乙醇的分布会影响atp的产出量，其必然会影响到细胞生物量的多少。总之，使用acetyl-coa作为中间代谢产物，合成气厌氧发酵可以产生乙酸和乙醇等有价值的化合物，也有可能积累微生物蛋白即微生物本身。
8、合成气厌氧发酵的产物比例取决于多种因素，包括菌株的选择、培养条件、营养物质供应、气体流量和传质等。微生物的代谢途径和生长条件对产物的分布有重要影响。在不同的环境和操作策略下，微生物可能会调整其代谢途径，导致产物比例的变化。例如，如果微生物更倾向于将acetyl-coa转化为乙醇，那么乙醇的产量就会占优势。相反，如果微生物将更多的acetyl-coa用于乙酸合成，那么乙酸可能会成为主要产物，并且因为有更多的atp生成，微生物细胞的浓度也可能相应的增加。如果能更多的让生产的乙酸，通过乙酸--乙醛--乙醇代谢通路转化成乙醇的话，会使得整个过程的乙醇产量增加，同时细胞浓度也随之增加。
9、本申请试图找到一种方法，在合成气发酵的产物乙酸、乙醇，以及微生物蛋白的生产方面，尽可能的使产物是价值较高的乙醇和微生物蛋白，而不是乙酸。如果再进一步比较乙醇和蛋白的话，希望更多的产物是微生物蛋白。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法。
2、本申请解决上述技术问题所采用的技术方案为：
3、一种提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其包括以下步骤：
4、(1)设计aor基因启动子附近的grna并合成该序列片段；
5、(2)构建crispra激活融合蛋白；
6、(3)构建crispra质粒；
7、(4)细菌转化及质粒提取；
8、(5)目标微生物转化；
9、(6)恢复和筛选菌株；
10、(7)使用步骤(6)得到的菌株采用合成气发酵产乙醇和微生物细胞。
11、进一步地，步骤(1)中所述的序列片段为：
12、正向grna序列：5′-cgcgtctgcgagcgcggcag-3′
13、反向grna序列：5′-ctgccgcgctcgcacgcgac-3′。
14、进一步地，步骤(2)中所述的构建crispra激活融合蛋白：使用dcas9-vp64作为激活融合蛋白的基础，与grna结合时，可精确地引导激活融合蛋白到目标基因的启动子区域。
15、进一步地，步骤(3)中所述crispra质粒构件方法为：使用puc19作为基本质粒骨架，将步骤(1)中合成的grna序列和步骤(2)中构建的激活融合蛋白基因插入质粒中，构建crispra质粒。
16、进一步地，步骤(4)中所述的细菌转化及质粒提取的方法：将构建好的crispra质粒导入适当的大肠杆菌(e.coli)细胞中，对大肠杆菌培养，进行质粒扩增；然后从e.coli细胞中提取合成的crispra质粒，准备用于目标微生物的转化。
17、进一步地，步骤(5)中所述的目标微生物转化：将构建好的crispra质粒导入目标微生物clostridium ljungdahlii(cl-wild)中，通过电转化的方法进行转化构建。
18、进一步地，所述的目标微生物转化的具体步骤包括：
19、细菌培养：在进行电转化前，将cl-wild培养至对数生长期，其浓度为od600在0.5左右；
20、预处理细胞：将培养的细菌通过离心和洗涤，获得适当数量的细菌，使其处于最佳状态；
21、质粒制备：提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的序列片段为：
3.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的构建CRISPRa激活融合蛋白：使用dCas9-VP64作为激活融合蛋白的基础，与gRNA结合时，可精确地引导激活融合蛋白到目标基因的启动子区域。
4.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中所述CRISPRa质粒构件方法为：使用pUC19作为基本质粒骨架，将步骤(1)中合成的gRNA序列和步骤(2)中构建的激活融合蛋白基因插入质粒中，构建CRISPRa质粒。
5.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljun
6.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的目标微生物转化：将构建好的CRISPRa质粒导入目标微生物Clostridium ljungdahlii中，通过电转化的方法进行转化构建。
7.根据权利要求6所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，所述的目标微生物转化的具体步骤包括：
8.根据权利要求7所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，所述的电转化条件：
9.根据权利要求1所述的提高Clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的恢复和筛选菌株：在电转化后，细菌需要在培养基中进行恢复；选择强化梭菌培养基在严格厌氧条件下培养微生物，得到利用合成气发酵提高乙醇产量和细胞浓度的菌株CL-P1006。
...【技术特征摘要】
1.一种提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的序列片段为：
3.根据权利要求1所述的提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的构建crispra激活融合蛋白：使用dcas9-vp64作为激活融合蛋白的基础，与grna结合时，可精确地引导激活融合蛋白到目标基因的启动子区域。
4.根据权利要求1所述的提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中所述crispra质粒构件方法为：使用puc19作为基本质粒骨架，将步骤(1)中合成的grna序列和步骤(2)中构建的激活融合蛋白基因插入质粒中，构建crispra质粒。
5.根据权利要求1所述的提高clostridium ljungdahlii合成气发酵产乙醇和微生物细胞浓度的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的细菌转化及质粒提取的方法：将构...
【专利技术属性】
技术研发人员：李长沙，刘金课，周堃，符波，
申请(专利权)人：中邦碳能江苏科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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