【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，尤其涉及ages-rage信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用。
技术介绍
1、骨关节炎(osteoarthritis，oa)是全世界最常见的关节疾病，大概影响到60岁以上人口中10％的男性和18％的女性。骨关节炎所造成的疼痛和虚弱可严重降低患者的生活质量。膝骨关节炎(kneeoa，koa)是最常见的骨关节炎之一，目前膝骨关节炎的治疗主要包括疼痛管理和终末期关节置换术。长期的药物治疗往往难以避免出现相关的药物并发症，而进行关节置换术则需要承担手术风险且假体寿命有限。这些方法并未能从早期阻止膝骨关节炎的发展。对膝骨关节炎发病机制的更好理解与对疾病活动性检测的改进相结合，正在促进人们将注意力转移到早期膝骨关节炎的预防和治疗上。
2、膝关节半月板是两个新月形的纤维软骨盘，位于膝关节内侧和外侧的股骨和胫骨的表面之间，半月板在膝关节中承受许多不同的力，例如剪切力、张力和压缩力。半月板在关节软骨的承重、负荷传递、减震以及润滑和营养中起着至关重要的作用。有研究表明半月板钙化可能是骨关节炎影像学上最早期的线索，同时将加速骨关节炎的进展。但是既往不论是临床研究还是基础研究对半月板钙化的关注都很有限。
3、目前针对半月板钙化形成的原因尚不十分清楚，有研究认为细胞外焦磷酸盐(ppi)的水平起到了重要作用，ppi的生理水平由不同的机制维持，以防止关节软骨细胞和半月板的病理性钙化，这些机制在骨关节炎中变得失调。ho等人发现，小鼠中钙化浆细胞膜糖蛋白-1(pc-1)的缺失会导致广泛的关节、
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供ages-rage信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用，通过本专利技术中的研究发现，在半月板细胞成骨分化过程中，mtor活性及atf4蛋白水平急剧升高并受到ages-rage信号调控，mtor及atf4作为ages-rage的下游在半月板细胞成骨过程中发挥了重要作用，而半月板细胞成骨分化直接导致半月板钙化增加，为半月板钙化形成的机制提供了新的见解。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、ages-rage信号在调控半月板钙化中的作用，其特征在于：ages-rage信号通过正向调控下游信号通路调控半月板细胞成骨分化，半月板细胞成骨分化导致半月板钙化增加。
4、进一步的，ages-rage信号的下游信号通路包括mtor和atf4。
5、进一步的，ages-rage信号调控mtor活性及atf4蛋白水平升高，mtor及atf4促进半月板细胞成骨分化。
6、进一步的，atf4与mtor形成正反馈环，mtor通过减少atf4的泛素化来抑制其降解，导致atf4蛋白水平增加，而atf4通过增加精氨酸摄取来激活mtor。
7、进一步的，ages-rage信号在调控半月板钙化中的作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
8、s1：通过临床样本、半月板原代细胞及小鼠模型，明确ages-rage信号对于半月板细胞成骨及半月板钙化形成的影响，结合生物信息学分析寻找ages-rage的下游通路；
9、s2：通过临床样本、半月板原代细胞及小鼠模型，明确ages-rage下游通路之间的相互作用以及ages-rage下游通路与半月板钙化形成的作用。
10、进一步的，ages-rage的下游通路包括mtor和atf4。
11、进一步的，步骤s1的具体操作包括以下步骤，
12、s101：收集人膝关节原代半月板组织临床样本；
13、s102：对收集到的临床样本进行micro-ct扫描，然后制备石蜡切片；
14、s103：对石蜡切片进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色和免疫荧光检测；
15、s104：半月板原代细胞提取，冻存备用；
16、s105：半月板原代细胞进行成骨分化诱导；
17、s106：构建atf4稳定敲低的慢病毒载体，并进行质粒的扩增与提取；
18、s107：使用慢病毒对半月板原代细胞进行感染；
19、s108：对半月板原代细胞组织及细胞的总蛋白进行提取和测定，并进行蛋白免疫印迹；
20、s109：对半月板原代细胞组织及细胞的总rna进行提取和测定，并进行rna的逆转录和实时荧光定量pcr以及gsea分析；
21、s110：构建小鼠aclt诱导的koa模型，制作小鼠膝关节石蜡切片；
22、s111：对小鼠膝关节石蜡切片进行番红固绿染色和oarsi评分；
23、s112：对实验结果和数据进行分析。
24、进一步的，步骤s2的具体操作包括以下步骤，
25、s201：对半月板原代细胞进行免疫沉淀；
26、s202：质谱分析检测代谢物含量；
27、s203：对半月板原代细胞内精氨酸含量进行检测；
28、s204：对实验结果和数据进行分析。
29、进一步的，ages-rage信号通路调节剂在制备防治半月板钙化的药物或试剂盒中的应用。
30、本专利技术的有益效果是：
31、1、本专利技术中通过收集患者半月板样本后根据糖化血红蛋白水平分组，micro-ct扫描评估钙化情况，wb、免疫荧光及茜素红染色评估ages-rage在半月板中的活性及与钙化灶的关系。分离提取原代半月板细胞，wb及qrt-pcr分析成骨过程中ages-rage信号蛋白水平变化，并通过茜素红染色和alp染色观察使用外源性ages或rage小分子抑制剂ttp488处理对半本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用，其特征在于：AGEs-RAGE信号通过正向调控下游信号通路调控半月板细胞成骨分化，半月板细胞成骨分化导致半月板钙化增加。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：AGEs-RAGE信号的下游信号通路包括mTOR和ATF4。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：AGEs-RAGE信号调控mTOR活性及ATF4蛋白水平升高，mTOR及ATF4促进半月板细胞成骨分化。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：ATF4与mTOR形成正反馈环，mTOR通过减少ATF4的泛素化来抑制其降解，导致ATF4蛋白水平增加，而ATF4通过增加精氨酸摄取来激活mTOR。
5.AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
6.根据权利要求书5所述的研究方法，其特征在于，AGEs-RAGE的下游通路包括mTOR和ATF4。
7.根据权利要求书5所述的研究方法，其特征在于，步骤S1的具体操作包括以下步骤，
8.根据权利要
9.AGEs-RAGE信号通路调节剂在制备防治半月板钙化的药物或试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.ages-rage信号在调控半月板钙化中的作用，其特征在于：ages-rage信号通过正向调控下游信号通路调控半月板细胞成骨分化，半月板细胞成骨分化导致半月板钙化增加。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：ages-rage信号的下游信号通路包括mtor和atf4。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：ages-rage信号调控mtor活性及atf4蛋白水平升高，mtor及atf4促进半月板细胞成骨分化。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：atf4与mtor形成正反馈环，mtor通过减少atf4的泛素化来抑制其降...
【专利技术属性】
技术研发人员：张洋，李乐，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：
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