【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药，具体而言，涉及白细胞介素15蛋白(il-15)突变体及其应用。
技术介绍
1、白细胞介素15(白介素15，il-15)是一种分子量约为12-14kd的细胞因子，天然人白介素15成熟肽含有114个氨基酸，包括4个半胱氨酸残基，其中cys35与cys85、cys42与cys88连接，形成的两对分子内二硫键对于保持il-15的空间构象和生物学活性起重要作用。
2、白介素15受体(il-15r)由α(又称cd215)、β(又称cd122)和γ(又称cd132)三个亚基组成。il-2和il-15的受体共用β和γ链，但il-2和il-15均有其各自特异性α受体链。il-15rα受体大量表达于抗原递呈细胞apc或巨噬细胞等表面，由于il-15与il-15rα受体亲和力很高(kd～10-11m)，所以il-15会大量的被抗原递呈细胞(apc)捕获，通过一种反式(trans)相互作用的形式，进一步再结合t细胞表面的β和γ受体而激活t细胞。il-15单独结合α受体时并不能激活下游通路。il-15与il-15rβγ异源二聚体的亲和力中等(kd～10-9m)，是传导下游信号通路的主要方式。2005年，法国的erwan mortier等人发现，il-15在结合α受体中的sushi结构域后，能够发生一定的构象变化而增强对il-15rβγ异源二聚体的亲和力(大约提高10倍)，从而增强il-15的生物学功能，因此，无论从生物学功能上，还是il-15对βγ受体的结合能力上，il-15结合其α受体均具有重要的意义。由于il-2和il
3、在大多数情况下il-15和il-15rα受体在相同细胞中表达后，在胞内il-15与il-15rα受体的sushi结构域以高亲和力结合后转运至膜表面，然后与其反应性细胞(如t细胞或nk细胞)膜表面的βγ异源二聚体复合物或αβγ异源三聚体复合物结合，β和γ受体可分别活化下游通路，最终达到激活t细胞和nk细胞的作用。因此，博际生物的bj-001,sushi-il15-apo、immunity-bio的n-803、altor bio-science alt-803、恒瑞的shr-1501等利用α亚基的特点，用融合或非融合的方法将il-15与α受体(或其部分)形成复合物，并在动物试验中显示了良好的生物效价及稳定性。虽然融合il-15的α受体或其sushi结构域，能够显著的提高il-15同βγ受体的亲和力，从而增强其抗肿瘤活性，但与天然的il-15相比，融合α受体或其sushi结构域的il-15衍生物不能够再次结合体内的α受体，因此该类分子不能够结合到apc上以反式相互作用的方式去激活t细胞，进而影响其抗肿瘤效果。同时，游离的高活性il-15分子也可能产生药物毒性，比如(1)触发细胞因子级联反应，包括tnfα，il1，il6，gm-csf以及促炎性细胞因子的产生；(2)对有些肿瘤进展是起促进作用，帮助肿瘤的增殖，存活和扩散；(3)可能会活化自身反应性t细胞并参与自身免疫性疾病过程。因此，通过蛋白质工程学改造的手段，使il-15在不结合sushi结构域情况下，具备对β和γ受体的高亲和力，成为il-15改造的一个新的方向。
4、此外，尽管il-15较il-2有着更高的安全性及活性，但作为蛋白类药物，天然野生型的il-15存在明显的药物开发瓶颈，包括原核生物和真核生物表达的表达量低、纯化困难、半衰期短和容易形成异构体(isomer)等，从而难以进行产业化。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种il-15蛋白突变体。本专利技术通过在天然野生型il-15(seq id no:1)分子中引入一对二硫键，提高il-15构象稳定性，在不依赖sushi结构域的情况下，显著增强了其对β和γ受体的亲和力和生物学活性以及高生产效能。本专利技术还提供了这种il-15突变体的其他分子形式，如融合fc，偶联脂肪酸链，以提高il-15的半衰期，使其具有长效性。
2、本专利技术中所有氨基酸顺序标号均以天然野生型il-15(seq id no:1)序列为准。由于本专利技术中的il-15使用大肠杆菌表达，所以最终所有蛋白的氮端(n端)均带有一个起始氨基酸甲硫氨酸(met，即第1位)，同时由于第77-78位存在asn-gly序列，导致第77位asn易发生脱氨基反应，所以本专利技术中所有il-15序列均含有g78a突变，以去除第77位asn的脱氨基反应(wt-il-15，seq id no:2)，以上突变均不影响il-15的活性(参照nellis df,michieldf,jiang m-s,et al..characterization of recombinant human il-15deamidationand its practical elimination through substitution of asparagine 77.pharm res2012；29:722–38.)。因此，本专利技术中所述的野生型il-15的氨基酸序列如seq id no:2所示。
3、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
4、第一方面，本专利技术提供一种人白细胞介素15蛋白(il-15)突变体，所述的突变体为在天然野生型il-15的氨基酸序列中，第21位至29位之间任意选取一个氨基酸突变为cys，在第91位至96位之间任意选取一个氨基酸突变为cys，并在两个突变的cys之间形成二硫键，所述天然野生型il-15的氨基酸序列如seq id no.1所示，同时，在seq id no.1的n端添加一个甲硫氨酸，将第78位的gly突变为ala。
5、在本专利技术一个优选的实施方案中，所述的突变体为：将野生型il-15的氨基酸序列的第24位thr、第93位glu，都突变为cys，并在两个突变的cys之间形成二硫键，所述il-15突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、第二方面，本专利技术提供一种人白介素15突变体-fc的融合蛋白，所述融合蛋白的人白介素15突变体为第一方面所述的il-15突变体，fc片段包括部分铰链区、ch2区和ch3区，所述il-15突变体与fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所述的fc片段选自人或动物的igg、igm、igd、iga或者它们的亚型。
7、在本专利技术一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的fc片段选自人igg4序列。
8、根据本专利技术，所述融合蛋白选自氨基酸序列如seq id no.8所示的il-15(g78a,t27c,e92c)-fc，氨基酸序列如seq id 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人白细胞介素15蛋白IL-15突变体，其特征在于，所述的突变体为在天然野生型IL-15的氨基酸序列中，第21位至29位之间任意选取一个氨基酸突变为Cys，在第91位至96位之间任意选取一个氨基酸突变为Cys，并在两个突变的Cys之间形成二硫键，所述天然野生型IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时，在SEQ ID NO.1的N端添加一个甲硫氨酸，将第78位的Gly突变为Ala；
2.一种人白介素15突变体-Fc的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的人白介素15突变体为权利要求1所述的IL-15突变体，Fc片段包括部分铰链区、CH2区和CH3区，所述IL-15突变体与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所述的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型；
3.一种能够表达权利要求1所述的IL-15突变体或权利要求2所述的融合蛋白的载体；
4.一种包含权利要求3所述载体的宿主细胞；
5.一种人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为权利要求1所述的IL-15突变体的C
6.一种C端偶联脂肪酸链的IL-15突变体的制备方法，其特征在于，所述方法通过在IL-15或其突变体的C末端添加含有LPXTG(X为任意氨基酸)实现，优选的，添加的序列为-GS-LPETG-GSGGS-HHHHHH，含有此序列的IL-15突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的IL-15-1303，IL-15-1303通过Sortase-A酶的催化，被权利要求5所述的脂肪酸链修饰偶连，修饰后的IL-15突变体的结构为：IL-15突变体-LPXT-GGG-脂肪酸链；
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白IL-15突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-Fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
8.一种用于刺激或抑制哺乳动物免疫应答的方法，其特征在于，包括：向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-Fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物、或权利要求7所述的药物组合物。
9.一种权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-Fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物、或权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗IL-15介导的疾病或病症的药物中的用途，其特征在于，其中所述的疾病可以为传染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。所述的癌症优选黑色素瘤、结直肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、实体瘤、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌；所述的传染病优选天花病毒感染、HIV感染、细菌感染、真菌感染、HBV感染；所述的血液病优选贫血、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、T-细胞大颗粒淋巴细胞性白血病；所述的自身免疫性疾病优选多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎；所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或人白介素15突变体-Fc融合蛋白、或人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物、或药物组合物可以单独使用，也可以与其它药物联合使用，所述其它药物为小分子抑制剂或抗体类药物，所述的小分子抑制剂优选靶向化疗药物或放射治疗药物，进一步优选烷化剂；所述的抗体类药物优选单克隆抗体药物，进一步优选抗CD20、PD1、PDL1、Her2、EGFR、c-MET抗体。
10.一种治疗或预防疾病的方法，其特征在于，所述方法包括但不仅限于药物化疗、放射性治疗、手术治疗等方式；在所述疾病中，细胞表达疾病相关抗原，所述方法包括：向患者施予权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-Fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物、或权利要求7所述的药物组合物；在表达疾病相关抗原的细胞与表达IL-15Rα的免疫细胞之间形成足以活化所述免疫细胞的特异性结合复合物；以及通过所述免疫细胞杀死所述表达疾病相关抗原的细胞；其中所述表达疾病相关抗原的细胞优选为肿瘤细胞或病毒感染细胞；其中所述的免疫细胞优选为T-细胞、LAK细胞或NK...
【技术特征摘要】
1.一种人白细胞介素15蛋白il-15突变体，其特征在于，所述的突变体为在天然野生型il-15的氨基酸序列中，第21位至29位之间任意选取一个氨基酸突变为cys，在第91位至96位之间任意选取一个氨基酸突变为cys，并在两个突变的cys之间形成二硫键，所述天然野生型il-15的氨基酸序列如seq id no.1所示；同时，在seq id no.1的n端添加一个甲硫氨酸，将第78位的gly突变为ala；
2.一种人白介素15突变体-fc的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的人白介素15突变体为权利要求1所述的il-15突变体，fc片段包括部分铰链区、ch2区和ch3区，所述il-15突变体与fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所述的fc片段选自人或动物的igg、igm、igd、iga或者它们的亚型；
3.一种能够表达权利要求1所述的il-15突变体或权利要求2所述的融合蛋白的载体；
4.一种包含权利要求3所述载体的宿主细胞；
5.一种人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为权利要求1所述的il-15突变体的c端偶联脂肪酸链，所述脂肪酸链为：(1)通式为ggg-linker-(ch2)x-cooh，或，(2)其它含有脂肪酸链的化学结构，其中(1)通式中的linker部分包括但不仅限于peg-linker(聚乙二醇)、多肽链、oeg等，(ch2)x中x的数目介于10-20之间；优选的，x介于16-20之间；
6.一种c端偶联脂肪酸链的il-15突变体的制备方法，其特征在于，所述方法通过在il-15或其突变体的c末端添加含有lpxtg(x为任意氨基酸)实现，优选的，添加的序列为-gs-lpetg-gsggs-hhhhhh，含有此序列的il-15突变体为氨基酸序列如seq id no.5所示的il-15-1303，il-15-1303通过sortase-a酶的催化，被权利要求5所述的脂肪酸链修饰偶连，修饰后的il-15突变体的结构为：il-15突变体-lpxt-ggg-脂肪酸链；
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白il-15突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
8.一种用于刺激或抑制哺乳动物免疫应答的方法，其特征在于，包括：向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-fc融合蛋白、或权利要求5所述的人白细胞介素15蛋白突变体的衍生物、或权利要求7所述的药物组合物。
9.一种权利要求1所述的人白细胞介素15蛋白突变体、或权利要求2所述的人白介素15突变体-fc融合蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄英姿，高翔，赵艳宇，张天赋，张玉，刘懿，张建军，刘玉姣，王国永，张秋磊，王雅媛，
申请(专利权)人：北京志道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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