【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品加工，具体涉及一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法。
技术介绍
1、食品腐败通常指发生微生物、化学或物理变化，使食品品质发生改变，达到无法被消费者接受的程度。当食物中的不同成分相互反应或与添加的某些改变食物感官特性的成分发生反应时，食物就会发生化学变质，例如氧化、酶促褐变和非酶褐变。潮湿的食物过度脱水或干燥的食物吸收过多的水分时，食物的物理腐败就会发生；微生物大量生长繁殖，代谢形成生物胺、硫化物和有机酸等副产物，也会导致食品的腐败。
2、微生物的生长繁殖是引起食品腐败变质最主要的原因。全球食物约有25％是因为发生微生物腐败而造成的食品损失，是全球密切关注的问题。腐败变质不仅会降低食品的营养价值，产生的腐败微生物及其毒素在内的多种有毒有害物质还会带来食品安全问题，威胁消费者的身体健康和生命安全。低温肉制品在加工过程中使用的加热温度较低，虽然可以杀灭绝大多数微生物，但不能完全杀死细菌芽孢和一些耐热菌，再加上原料肉初始微生物数量较多，生产过程中受到外界环境污染等问题，使微生物在产品的贮藏、运输和销售过程中容易生长和繁殖，保质期较短。肉制品中常见的腐败微生物有：革兰氏阴性需氧嗜冷的假单胞菌(pseudomonas)、醋酸杆菌(acinetobacter)、气单胞菌(aeromonas)和兼性厌氧的肠杆菌(enterobacteriaceae)，以及革兰氏阳性的葡萄球菌(staphylococcus)、乳杆菌(lacotbacillus)、热杀索丝菌(brochothrix themosphacat)。
3、乳酸菌对食品有益，常用于各种食品和原材料的发酵，有助于形成特色风味、质地并有延长保质期的作用，但一些物种可以在食品腐败中发挥重要的控制作用。乳酸菌是真空包装低温肉制品中常见的优势腐败菌群。胡萍在真空包装烟熏火腿切片中发现清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)是导致腐败的优势菌群。除了乳酸菌，假单胞菌(pseudomonas)和肠杆菌(lactobacillus)也是低温肉制品中常见的腐败菌。假单胞菌能在低温下生长繁殖，分解蛋白质和脂肪的能力较强，尤其是荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)。余娟在探究导致盐水鹅腐败变质的微生物中分离出了荧光假单胞菌。肉制品的腐败通常伴随着异味的产生，这些异味主要来源于微生物代谢产生的挥发性物质，肠杆菌科细菌能够将氨基酸代谢出有恶臭味的挥发性化合物，如二胺和硫酸盐，在食品腐败中发挥关键作用。
4、肉鸽是广东特色肉类食品，因其营养丰富、肉质鲜美，近年来越来越受到消费者的喜爱，在我国的肉品消费市场比重也在逐年上升。目前，国内肉鸽的消费方式以冰鲜鸽和在餐馆热菜销售为主，低温加工的方式可以更好的保证肉鸽鲜嫩的口感，并且不容易破坏其营养成分，因此可以将肉鸽的生产产业链向低温肉制品延伸。由于加工过程中未经高温处理，并不能完全杀死一些芽孢和耐热菌，同时产品在真空包装低温贮藏条件下，厌氧及兼性厌氧的微生物容易滋生和繁殖，产品容易出现发粘、发酸、涨袋和变色等质量问题，缩短产品的储存寿命。因此，找出与其品质变化相关的微生物是延长此类产品货架期及促进低温肉鸽制品产业发展的基础。
5、基于上述现有技术，急需一种能够适用酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的鉴定方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法，使其解决酱卤乳鸽中菌群复杂、储藏过程中不断变化、特定腐败菌难以鉴定的问题，获得了测定范围广、结果准确和精度高等技术效果，方便用于判断酱卤乳鸽的储藏期和食用安全性。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法，包括如下步骤：
4、1)取样
5、对储藏过程中的酱卤乳鸽进行间隔取样，获得不同储藏时期的样品；
6、2)处理
7、所述样品置于带滤膜的无菌袋中，加入无菌生理盐水浸泡后进行多次离心操作，将下层菌体沉淀转移至冻存管中保存；
8、3)高通量测序
9、采用pcr扩增技术对16s rdnav3-v4区进行扩增，所用的引物序列为341f(5’-cctacgggnggcwgcag-3’)和805r
10、(5’-gactachvgggtatctaatcc-3’)；
11、4)微生物分离纯化
12、从菌落计数结束后生长数目在30-300cfu的平板，根据菌落特征，从每种培养基上挑取5-10个菌落，采用平板划线的方式接种于相应的培养基上，重复多次，直到得到纯化的单菌落；再通过革兰氏染色、显微镜镜检和过氧化氢酶试验进行初步筛选，挑取的纯菌落富集后，保存备用。
13、5)微生物鉴定
14、将步骤4)中的纯菌落进行dna提取、16s rdnav3-v4区pcr扩增及测序，上游引物为27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)，下游引物为1492r(5’-aaggaggtgatccagccgca-3’)。
15、进一步地，步骤1)中所述间隔取样为分别在酱卤乳鸽储藏的第0、10、20、30、35、40、45、50d进行无菌取样，每次取样100g。
16、进一步地，步骤2)中所述无菌生理盐水为100ml，浸泡时间为10min。
17、进一步地，步骤2)中所述多次离心操作为取浸泡后的50ml滤液于离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心10min，随后移取上清液20ml到一个新的离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心20min；所述冻存管为2ml冻存管；所述保存条件为-80℃。
18、进一步地，步骤3)中高通量测序的扩增反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环20次；72℃末端延伸10min，4℃条件下保温。
19、进一步地，步骤3)中高通量测序的pcr扩增反应体系为：h2o为10.5μl，gdna(30ng)为1μl，2×kapahifimix为12.5μl，3af-p1r(10μm)为1.0μl。
20、进一步地，步骤4)中所述菌落特征包括形态、大小、边缘结构、颜色。
21、进一步地，步骤4)中所述培养基具体为：菌落总数选用平板计数培养基及36℃/48h培养条件，肠杆菌选用vrba琼脂培养基及36℃/24h培养条件，葡萄球菌选用baird-parker琼脂培养基及36℃/48h培养条件，乳酸菌选用mrs琼脂培养基及36℃/72h培养条件，假单胞菌选用cfc培养基及28℃/48h培养条件，热杀索丝菌选用staa培养基及28℃/48h培养条件，霉菌和酵母选用孟加拉红培养基及28℃/5d培养条件。
22、进一步地，步骤4)中挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后，用甘油保存本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述间隔取样为分别在酱卤乳鸽储藏的第0、10、20、30、35、40、45、50d进行无菌取样，每次取样100g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述无菌生理盐水为100mL，浸泡时间为10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述多次离心操作为取浸泡后的50mL滤液于离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心10min，随后移取上清液20mL到一个新的离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心20min；所述冻存管为2mL冻存管；所述保存条件为-80℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述菌落特征包括形态、大小、边缘结构、颜色。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述培养基具体为：菌落总数选用平板计数培养基及36℃/48h培养条件，肠杆菌选用VRBA琼脂培养基及36℃/24h培养条件，葡萄球菌选用Baird-
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后，用甘油保存在-80℃冰箱中备用。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中PCR反应体系为：模板DNA为1μL体积，上游引物为10μM浓度1μL体积，下游引物为10μM浓度1μL体积，Dntp(mix)为10mM浓度1μL体积，Taq Buffer(with MgCl2)为10X浓度2.5μL体积，Taq酶为5U/μL浓度0.2μL体积，加ddH2O至25μL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中PCR反应程序为：①预变性——95℃下5min，②变性——94℃下30sec，③退火——63℃下30sec且每循环降0.5℃，④延伸——72℃下30sec，⑤循环②-④10cycles，⑥变性——95℃下30sec，⑦退火——58℃下30sec，⑧延伸——72℃下30sec，⑨循环⑥-⑧30cycles，⑩修复延伸——72℃下10min，保温——4℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，将测序结果通过NCBI数据库进行Blast相似序列检索和序列比对，序列同源性超过97％即视为同一物种。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述间隔取样为分别在酱卤乳鸽储藏的第0、10、20、30、35、40、45、50d进行无菌取样，每次取样100g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述无菌生理盐水为100ml，浸泡时间为10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述多次离心操作为取浸泡后的50ml滤液于离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心10min，随后移取上清液20ml到一个新的离心管中，在4℃和4000rpm条件下离心20min；所述冻存管为2ml冻存管；所述保存条件为-80℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述菌落特征包括形态、大小、边缘结构、颜色。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述培养基具体为：菌落总数选用平板计数培养基及36℃/48h培养条件，肠杆菌选用vrba琼脂培养基及36℃/24h培养条件，葡萄球菌选用baird-parker琼脂培养基及36℃/48h培养条件，乳酸菌选用mrs琼脂培养基及36℃/72h培养条件，假单胞菌选用cfc培养基及28℃/48h培养条件，热杀索丝菌选用staa...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗赛，刘巧瑜，姚丽锋，曾令智，王小玉，黄伟英，黎财慧，吴松起，游淑珠，
申请(专利权)人：珠海市金同农产品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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