【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种环状rna的制备方法。
技术介绍
1、环状rna(circular rnas，circrnas)是一种区别于传统线性rna分子的rna家族新成员。天然存在的环状rna广泛存在于各种生物细胞中，它不具有线性rna分子的5’端帽子结构与3’端尾巴结构，大多数是通过“反向剪切”(backsplicing)机制形成的共价闭合环状结构[1-2]。
2、其中内含子是一类具有酶催化功能的分子，具有自我剪接功能，在剪接反应中可形成circrna，例如i类内含子或ii类内含子。i类内含子的剪切反应需要鸟嘌呤核苷酸(含有游离的3'-oh)g-oh的参与。鸟嘌呤核苷酸的3'-oh通过亲核进攻rna剪切位点保守序列，使rna断裂并产生裸露的3’羟基，进而引发后续亲核反应，最终经过催化内含子的双重酯交换反应，产生环状mrna(circrna)[3]。这种自我剪接，是由rna的特定序列的核酸内切酶的活性所催化。
3、镁离子等二价金属离子是核酶催化核心的组分之一，核酶通过碱基配对与其底物接触并发生相互作用，二价阳离子的存在可与底物的活性部位直接作用，参与过渡态的中间复合物的形成，形成类似酶的活性中心，辅助剪接反应进行。
4、目前在制备circrnas过程中，首先通过体外转录反应获得线性mrna前体，后在一定温度辅助因子mg2+的作用下，线性mrna前体可自催化反应形成circrnas。但是该种成环反应提供的不稳定环境，导致mrna在环化的过程中会发生开环甚至降解的现象。danielg.and
5、因此，在circrnas制备过程中，如何有效抑制circrnas的开环与降解，提高circrnas产量，是当前亟需解决的重要问题。
6、引用文献：
7、[1]eger n,schoppe l,schuster s,laufs u,boeckel jn.circular rnasplicing.adv exp med biol.2018；1087:41-52.
8、[2]fanale d,taverna s,russo a,bazan v.circular rna in exosomes.advexp med biol.
9、[3]puttaraju m,been md.group i permuted intron-exon(pie)sequencesself-splice to produce circular exons.nucleic acids res.1992；20(20):5357-5364.
10、[4]wesselhoeft ra,kowalski ps,anderson dg.engineering circular rnafor potent and stable translation in eukaryotic cells.nat commun.2018 jul 6；9(1):2629.
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、针对上述在制备circrnas的过程中，随环化反应时长增加，circrna发生开环与降解的问题，本专利技术拟提供一种环状rna的制备方法。本研究发现在环化反应结束后，及时终止环化反应，可以显著抑制circrna开环情况的发生。克服了circrnas生产过程中由于环化体积大、降温时间不可控而导致的circrnas纯度不稳定的难点，可为获得纯度较高的circrnas工业化生产提供新的策略。
3、在一些实施方案中，本专利技术通过在成环反应后加入乙二胺四乙酸(edta)或其盐中和镁离子，可终止mrna环化反应并显著抑制circrna的开环，以获得纯度较高的circrna。
4、用于解决问题的方案
5、[1]、一种环状rna的制备方法，其包括如下所示的步骤：
6、环化反应步骤：在包含二价金属阳离子的环化体系中，对线状rna进行环化处理，使所述线状rna形成环状rna；
7、终止步骤：向所述环化体系中加入二价金属阳离子螯合剂，使所述环化反应终止，得到包含环状rna的环化终止体系。
8、[2]、根据[1]所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸盐；
9、可选的，所述环状rna的制备方法包括如下(a)～(b)所示的步骤：
10、(a)在包含二价金属阳离子的环化体系中对线状rna进行环化处理，得到包含环状rna的待终止的环化体系；
11、(b)向待终止的环化体系中加入乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸盐，使所述环化反应终止，得到环化终止体系。
12、[3]、根据[2]所述的制备方法，其中，所述乙二胺四乙酸盐包括钠盐和钾盐；
13、可选的，所述乙二胺四乙酸盐包括乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸钙二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾和乙二胺四乙酸四钾。
14、[4]、根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂在所述环化终止体系中的物质的量浓度与所述二价金属阳离子在所述环化体系中的物质的量浓度的比值大于等于0.1:1；
15、可选的，所述二价金属阳离子螯合剂在所述环化终止体系中的物质的量浓度与所述二价金属阳离子在所述环化体系中的物质的量浓度的比值为(0.5～5):1；
16、优选的，所述二价金属阳离子螯合剂在所述环化终止体系中的物质的量浓度与所述二价金属阳离子在所述环化体系中的物质的量浓度的比值为(1～4):1。
17、[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子包括mg2+、ca2+、mn2+、cu2+、fe2+和zn2+中的至少一种；
18、优选的，所述二价金属阳离子为mg2+。
19、[6]、根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，所述线状rna包含来源于i类内含子的内含子片段或者ii类内含子的内含子片段；
20、可选的，所述i类内含子包括来源于如下任意一种的i类内含子：t4噬菌体td基因、鱼腥藻属trnaleu、tpacox2、ptu；
21、可选的，所述ii类内含子包括来源于如下任意一种的ii类内含子：酵母菌ii类内含子，破伤风杆菌ii类内含子。
22、[7]、一种终止rna环化反应的方法，其包括使用二价金属阳离子螯合剂终止r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环状RNA的制备方法，其包括如下所示的步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸盐；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述乙二胺四乙酸盐包括钠盐和钾盐；
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂在所述环化终止体系中的物质的量浓度与所述二价金属阳离子在所述环化体系中的物质的量浓度的比值大于等于0.1:1；
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子包括Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+和Zn2+中的至少一种；
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述线状RNA包含来源于I类内含子的内含子片段或者II类内含子的内含子片段；
7.一种终止RNA环化反应的方法，其包括使用二价金属阳离子螯合剂终止RNA环化反应的步骤；
8.一种RNA环化反应抑制剂，其中，所述抑制剂含有二价金属阳离子螯合剂；
9.根据权利要求8所述的抑制剂，
10.二价金属阳离子螯合剂在如下(c)～(f)至少一项中的用途：
...【技术特征摘要】
1.一种环状rna的制备方法，其包括如下所示的步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸盐；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述乙二胺四乙酸盐包括钠盐和钾盐；
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子螯合剂在所述环化终止体系中的物质的量浓度与所述二价金属阳离子在所述环化体系中的物质的量浓度的比值大于等于0.1:1；
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述二价金属阳离子包括mg2+、c...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱佳凤，左炽健，杜雅冉，翟梦婷，梅春雨，孙振华，
申请(专利权)人：苏州科锐迈德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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