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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测,尤其涉及一种用于快速检测转基因拷贝数的终止子序列及方法。
技术介绍
1、随着分子生物技术快速发展,特别是转基因技术的出现,给植物育种带来新的技术手段。转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此,检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。
2、目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有:比较基因组杂交技术(comparativegenome hybridization,cgh)、taqman荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,dhplc)技术、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,mlpa)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛,但其缺陷依旧明显:cgh技术分辨率在mb水平,更小片段的拷贝数片段则不易检出,同时该技术操作繁琐,通量低、耗时长且成本昂贵,需要较为大量的模板dna,不利于大范围的推广;taqman荧光探针合成原料成本高、获取难度大,且通常无法克服信噪比低的缺陷,实验数据可重复性差;dhplc技术在实践应用中,分辨力常受到实验设计、检测环境等因素的影响,存在可靠性和稳定性欠佳的问题;mlpa技术操作复杂,且需要毛细管电泳进行产物分析,整个实验耗时过长;新一代测序技术适合大样本的检测,但其依托的测序平台价格昂贵,且需要专业实验操作和数据分析人员,不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。<
...【技术保护点】
1.用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的终止子,其特征在于,所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,以OsUbi基因3'UTROsUbiTer为内源序列,在内源3'UTR OsUbiTer的序列中插入长度大于10bp的DNA指纹序列,得到转基因终止子OsUbiTer-T;基于所述转基因终止子OsUbiTer-T的序列,在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对;以转基因生物为待测样品;使用所述共用引物对,以待测样品的基因组DNA为模板,或者,分别以待测样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板,进行qPCR,得到PCR产物;分析所述PCR产物的熔解曲线,根据转基因终止子OsUbiTer-T序列熔解峰和内源3'UTR OsUbiTer序列熔解峰的荧光强度比值,判定转基因生物目的基因拷贝数;所述转基因终止子OsUbiTer-T序列熔解峰和内源3'UTR OsUbiTer序列熔解峰由待测样品的基因组DNA扩增产物熔解得到;所述转基因终止子OsUbiTer-T序列熔解峰和内源3'UTR Os
3.根据权利要求2所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述内源3'UTR OsUbiTer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,和/或,所述DNA指纹序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2或3所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述转基因终止子OsUbiTer-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求2-4任意一项所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,转基因生物目的基因拷贝数=K×(转基因终止子OsUbiTer-T序列熔解峰荧光值/内源3'UTR OsUbiTer序列熔解峰荧光值),K为常数。
6.根据权利要求2-5任意一项所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,
7.根据权利要求2-6任意一项所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述qPCR的反应体系以10μL计,包括0.5μl上游引物10μM,0.5μl下游引物10μM,5μl qCR Master Mix 2x,0.1μl CXR 100x*,1μl模板DNA 10±2ng,用ddH2O补足10μl。
8.根据权利要求2-7任意一项所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述qPCR的反应程序为:50℃,1min;94-95℃,7min;94-95℃,10-20sec;60-62℃收集荧光信号1min,共计25个循环;60℃-95℃持续收集荧光信号,建立熔解曲线;
9.利用所述OsUbiTer-T转基因终止子检测转基因生物目的基因拷贝数的试剂盒,其特征在于,包括所述共用引物对;
10.根据权利要求9所述利用OsUbiTer-T转基因终止子检测转基因生物目的基因拷贝数的试剂盒,其特征在于,所述DNA饱和性染料选自SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的终止子,其特征在于,所述终止子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,以osubi基因3'utrosubiter为内源序列,在内源3'utr osubiter的序列中插入长度大于10bp的dna指纹序列,得到转基因终止子osubiter-t;基于所述转基因终止子osubiter-t的序列,在所述dna指纹序列的两侧设计共用引物对;以转基因生物为待测样品;使用所述共用引物对,以待测样品的基因组dna为模板,或者,分别以待测样品的基因组dna和对照野生型样品的基因组dna为模板,进行qpcr,得到pcr产物;分析所述pcr产物的熔解曲线,根据转基因终止子osubiter-t序列熔解峰和内源3'utr osubiter序列熔解峰的荧光强度比值,判定转基因生物目的基因拷贝数;所述转基因终止子osubiter-t序列熔解峰和内源3'utr osubiter序列熔解峰由待测样品的基因组dna扩增产物熔解得到;所述转基因终止子osubiter-t序列熔解峰和内源3'utr osubiter序列熔解峰对应的温度差值≥0.8℃。
3.根据权利要求2所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述内源3'utr osubiter的核苷酸序列如seq id no.1所示,和/或,所述dna指纹序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求2或3所述用于快速检测转基因生物目的基因拷贝数的方法,其特征在于,所述转基因终止子osubiter-t的核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员:王健华,金雄霞,安保光,赵光苗,欧阳超,陈欣妍,
申请(专利权)人:海南波莲科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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