【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及生物技术药物领域，具体涉及一种具有溶酶体靶向性的胞外/膜蛋白降解能力的胰高糖素样肽-1及其应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、在过去的二十年中，靶向蛋白质降解技术作为一种可以消除“不可成药”的致病蛋白质的技术被迅速发展。多年来，通过利用体内天然蛋白质稳态机制，涌现了许多降解蛋白质的策略，例如，蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras，protacs)、自噬靶向嵌合体(autophagy-targeting chimeras，autacs)等，但这些策略仅针对细胞质中或具有细胞膜内结合结构域的蛋白质，靶向细胞外蛋白和膜蛋白降解技术仍有待开发。
2、2020年，斯坦福大学bertozzi教授课题组开发了溶酶体靶向嵌合体(lytacs)已成为降解分泌和膜锚定蛋白的策略。lytacs是一种异型双功能分子，是通过将细胞表面溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptors，ltrs)识别的配体与靶标结合部分偶联来构建的，该部分可以由小分子或大分子(即抗体、相关靶蛋白结合片段)组成，两者通过化学共价偶联，形成lytac，并与靶蛋白、ltr形成三元复合物(靶蛋白/lytac/ltr)，在ltr的协助下介导靶蛋白内吞到胞内，随后在溶酶体中被降解。到目前为止，ltr的配体化学结构形式从开始的低聚糖，如甘露糖、n-乙酰半乳糖胺(galnac)等，到开发了相关合成较简易的核酸适配体，扩展了lytacs。然而，目前只有少数几个的ltr被开发并
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)及在降解细胞外或细胞膜蛋白中的应用，特别是利用溶酶体途径靶向降解细胞外或细胞膜蛋白，以叠氮修饰的为配体通过点击反应连接到靶蛋白结合分子上，随后通过细胞膜上glp-1r受体将细胞外或细胞膜上的靶蛋白内化并进入溶酶体，从而诱导蛋白质特异性降解。本专利技术方法构建了一个基于偶联胰高血糖素样肽1(glp-1)的靶向降解平台(glp-1-lytac)，发现了一种新的ltr配体用于溶酶体靶向降解技术，能够特异地靶向并降解目的蛋白，不仅扩展了lytac框架，也为药物开发提供了更多可能。另外在体外进行化学修饰可以短时间内连接不同的抗体药物，使这个靶向降解平台具有多样性、便携性、高效性，可适用更多疾病的研究。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种胰高糖素样肽-1在溶酶体靶向降解细胞外或细胞膜蛋白中的应用。
4、优选的，所述胰高糖素样肽-1是经叠氮基修饰后的glp-1氨基酸序列如seq id no.1所示：haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrk，结果如图2所示。
5、优选的，所述应用是将经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1、靶蛋白或靶蛋白结合体和待降解的细胞共同孵育，经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1作为配体，与靶蛋白或靶蛋白结合体通过点击化学反应连接起来形成靶向降解平台(glp-1-lytac)，配体与细胞表面的受体glp-1r结合，进而将靶蛋白带到溶酶体中并且降解。
6、所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用能够与叠氮基团正交反应的二苯并环辛炔(dbco)修饰。优选，所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用二苯基环辛炔四聚乙二醇活性酯(dbco-peg-nhs)修饰。
7、优选的，所述细胞外或细胞膜蛋白中的细胞包括哺乳动物细胞，例如人宫颈癌细胞hela、人非小细胞肺癌细胞a549、人乳腺癌细胞mda-mb-231。
8、优选的，所述细胞外或细胞膜蛋白(即靶蛋白)包括绿色荧光蛋白(gfp)、表皮生长因子受体蛋白(egfr)、程序性死亡受体-配体1(pd-l1)。
9、优选的，所述egfr的降解是通过与二苯并环辛炔基(dbco)修饰的抗体药物西妥昔单抗cetuximab(ctx)(即ctxdbco，靶蛋白结合体)共同处理细胞，形成的溶酶体靶向嵌合体glp-1-lytac通过与细胞膜上的ltr受体glp-1r结合，进而ctxdbco和细胞膜上的egfr结合，glp-1r被激活导致快速内化和回收，将egfr带到溶酶体中并且降解。
10、优选的，所述pd-l1的降解是将二苯并环辛炔基(dbco)修饰的pd-l1单克隆抗体药物舒格利单抗sudubrilimab(hs636)(即hs636dbco，靶蛋白结合体)与glp-1n3共同处理细胞，形成的溶酶体靶向嵌合体glp-1-lytac通过与细胞膜上的ltr受体glp-1r结合，进而抗体药物hs636dbco和细胞膜上的pd-l1结合，glp-1r被激活导致快速内化和回收，将pd-l1带到溶酶体中并且降解。
11、本专利技术还提供一种用于靶向降解细胞外或细胞膜蛋白的溶酶体靶向嵌合体，所述溶酶体靶向嵌合体是将经叠氮基修饰后的与靶蛋白或靶蛋白结合体通过点击化学反应连接形成；所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用能够与叠氮基正交反应的二苯并环辛炔修饰。
12、本专利技术胰高糖素样肽-1基于溶酶体靶向降解细胞外或细胞膜蛋白的机理为：胰高糖素样肽-1是一种主要由肠道l细胞所产生的激素，其受体glp-1r属于g蛋白偶联受体b簇中胰高血糖素受体亚家族，它的典型特征是具有一个七次跨膜的核心域和一个相对比较大的胞外域。glp-1r与glp-1的结合方式主要是大家熟知的“two-domain model”，glp-1的c端先同glp-1r的胞外域结合，使glp-1r的空间构象发生改变，暴露出核心域的结合位点，然后glp-1的n端同glp-1r的核心域结合，激活glp-1r，引起glp1r/glp-1复合物的内吞作用。在内化和内体酸化后，glp-1进入溶酶体，而glp-1r重新分配到初级内体并再循环回质膜。本专利技术使用glp-1r作为溶酶体靶向受体，glp-1为溶酶体靶向受体glp-1r结合的配体，并对其进行修饰形成可利用点击反应偶联靶蛋白或靶蛋白结合体的得到溶酶体靶向嵌合体glp-1-lytacs，在内化和内体酸化后，glp-1进入溶酶体使得glp-1偶联的靶蛋白进入溶酶体被降解，或者靶蛋白结合体与靶蛋白结合后靶蛋白进入溶酶体被降解。
13、与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
14、1、本专利技术以经叠氮基修饰后的ltr识别的配体作为模块一，以dbco-peg-nhs修饰的靶蛋白或靶蛋白结合体(例如抗体药物)作为模块二，通过点击化学反应将配体和靶蛋白或靶蛋白结合体连接起来，构建了溶酶体靶向嵌合体glp-1-lytacs。本专利技术利用点击反应，使得两模块的结合在反应选择性、反应转化率及反应速率方面具有得天独厚的优势，可实现体外大规模的合成。本专利技术在细胞外自主连接，亦提供更多快速组合方式，也减少了两模块在识别靶点活力的影响。
15、2、本专利技术构建的溶酶体靶向嵌合体glp-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胰高糖素样肽-1在溶酶体靶向降解细胞外或细胞膜蛋白中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胰高糖素样肽-1是经叠氮基修饰后的GLP-1N3，GLP-1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1、靶蛋白或靶蛋白结合体和待降解的细胞共同孵育，经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1作为配体，与靶蛋白或靶蛋白结合体通过点击化学反应连接起来形成溶酶体靶向嵌合体GLP-1-LYTAC，配体与细胞表面的受体GLP-1R结合，进而将靶蛋白带到溶酶体中并且降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用能够与叠氮基正交反应的二苯并环辛炔修饰。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用二苯基环辛炔四聚乙二醇活性酯修饰。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外或细胞膜蛋白中的细胞包括人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDA-MB-231。
<...【技术特征摘要】
1.一种胰高糖素样肽-1在溶酶体靶向降解细胞外或细胞膜蛋白中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胰高糖素样肽-1是经叠氮基修饰后的glp-1n3，glp-1氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1、靶蛋白或靶蛋白结合体和待降解的细胞共同孵育，经叠氮基修饰后的胰高糖素样肽-1作为配体，与靶蛋白或靶蛋白结合体通过点击化学反应连接起来形成溶酶体靶向嵌合体glp-1-lytac，配体与细胞表面的受体glp-1r结合，进而将靶蛋白带到溶酶体中并且降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用能够与叠氮基正交反应的二苯并环辛炔修饰。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白或靶蛋白结合体采用二苯基环辛炔四聚乙二醇活性酯修饰。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外或细胞膜蛋白中的细胞包括人宫颈癌细胞hela、人非小细胞肺癌细胞a549、人乳腺癌细胞mda-mb-231。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞外或细胞膜蛋白包括绿色荧光蛋白g...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛璟燕，闫小巧，朱立权，蒋林冶，张蓓，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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