蛋白质纯化的方法及系统技术方案

本发明专利技术涉及一种纯化蛋白质的方法及其系统，其利用淀粉结合蛋白标签化重组蛋白而进行纯化。本发明专利技术还涉及淀粉结合蛋白结合基质以回收淀粉结合蛋白标签化重组蛋白。因此，通过本发明专利技术进行纯化是可再利用、方便并低廉的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质纯化的方法及系统，更具体地说，本专利技术涉及使用淀粉结 合蛋白的方法及系统。
技术介绍
通过于微生物系统表达以生产蛋白质已成为高价、医药用蛋白质的主要来源。纯 化及回收重组蛋白于设计发酵制程中为一重要考虑。而蛋白质纯化的传统方法可用于分离 产物，改良方法包含重组蛋白质的使用。重组蛋白可以亲和管柱层析法纯化，重组蛋白的所 需成分通过其共价性连接至多肽而纯化，该多肽连接于亲和性基质(亲和介质)。有某些通过亲和性管柱层析原理而用于分离蛋白质的系统存在。美国专利号第5，643，758号的专利描述了包含有麦芽糖结合蛋白 (maltose-binding protein，MBP)的系统。克隆基因(cloned gene)插入于来自可编码 出麦芽糖结合蛋白的malE基因pMAL载体下游(down-stream)。该载体可转化至寄主细胞 (host cell)，其后该重组蛋白可于该寄主细胞表达。该细胞的溶解产物或培养基部分可装 载于包含亲和性基质淀粉糖(amylose)的管柱并清洗数次，其后使用大量的麦芽糖抽提重 组蛋白。美国专利号第5，202，247号的专利描述了包含有纤维素结合区域 (cellulose-binding domain)的系统。纤维素管柱可用于纯化包含有纤维素结合区域的重 组蛋白。该细胞的溶解产物或培养基部分可装载于该管柱并清洗。纤维素结合区域与纤维 素的交互作用似乎是于中性PH值的疏水性交互作用而驱使。一般抽提方法使用低极性溶 剂例如乙二醇，在移除低极性溶剂前使用透析或过滤。这些现存蛋白质纯化系统具有某些缺点。其蛋白质纯化过程不方便且费力。用于 纯化的管柱是昂贵的。这些系统进行蛋白质纯化的限制包含无法在某些情况下分离重组蛋 白，例如含有EDTA的样品，以及现有使用的蛋白质标签与此专利技术的目标蛋白相比，相对较 大者。利用酵素产物于水中饲养现今尚存某些问题，例如(a)饲料加入水中后酵素快速 流失，以及(b)当饲料制锭温度高于100°C时酵素活性将会被破坏。相关申请案的交互参照此申请案主张下列的优先权于2009年05月15日申请的美国临时申请案第 61/178，816号。前述申请案揭示内容全体皆引用作为本说明书的参考数据。
技术实现思路
本专利技术的具体说明及简要描述如下，本专利技术的特征在于淀粉结合蛋白标签化重组 蛋白(starch binding protein (SBP) -tagged recombinant protein)、淀粉结合蛋白结合 基质(SBP-binding matrix)及其在蛋白质纯化的应用。在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含(a)提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(starch binding protein (SBP) -tagged recombinant protein)白勺溶液；(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质 (SBP-binding matrix)；(c)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；(d)将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组 蛋白以生成反应混合物；以及(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回 收重组蛋白。再者，在其它实施例中，提供一种纯化重组蛋白的系统，包含装置(a)，用于提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白的溶液；装置(b)，用于添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质；装置(C)，用于抽提碱性缓冲液至(b)的第一容器以获得混合物；装置(d)，用于将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋 白及重组蛋白以生成反应混合物；以及装置(e)，用于添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合 基质以回收重组蛋白。在某些方面，该淀粉结合蛋白结合基质包含淀粉、分枝淀粉(amylopectin)、 直链淀粉树脂(amylose resin)、糊精树脂(dextrin resin)或藻酸盐微粒(alginate beads)。在某些方面，(a)的淀粉结合蛋白标签化重组蛋白来自于细胞，且(b)淀粉结合蛋 白结合基质为淀粉。在其它方面，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。在其它方面，(d)的混合物进一步添加淀粉结合蛋白-内切蛋白酶 (SBP-endoprotease)。在特定方面，该淀粉结合蛋白-内切蛋白酶为淀粉结合蛋 白-急性严重呼吸道症候群蛋白酶(SBP-SARS protease)或淀粉结合蛋白-肠激酶 (SBP-enterokinase)。在另一方面，(a)的溶液具有4至6的pH值。在另一方面，(c)的缓冲液具有7至11的pH值。在又一方面，淀粉结合蛋白标签化重组蛋白于淀粉结合蛋白及目标蛋白间包含有 内切蛋白酶识别位置。 至7。在又一方面，(b)的溶液具有4至8的pH值。在再一方面，某些实施例于步骤(e)前进一步包含中和步骤用于调整pH值直到5在再一方面，某些实施例进一步包含中和装置，用于调整PH值直到5至7。 在某些实施例中，提供一种具有热稳定性的重组蛋白，其以上述任一实施例的方 法制备，其中该重组蛋白以淀粉结合蛋白标签及目标蛋白而融合。 在其它方面，该目标蛋白指脂酶(Lipase)、聚木糖酶(Xylanase)或植酸酶 (Phytase)0在其它实施例中，提供一种用于制备重组蛋白的方法，该重组蛋白包含有淀粉结 合蛋白标签及蛋白质A(ProteinA),其中该重组蛋白通过酵母菌或细菌而表达。在某些方面，该酵母菌为准赤酵母属(Pichia)。在某些方面，该细菌为大肠杆菌(E. coli)。本专利技术中一或多个实施例的细节将于下详细描述。而本专利技术的其它特征及优点将 由下述的详细描述及权利要求中显现。上述的一般性描述及后述的详细描述可通过例子而理解，且可提供如本专利技术所主 张的进一步解释。附图说明图1表示一种系统，该系统设计用于高度专一性切割地融合蛋白质，接着将其快 速、亲和性为主地获取并移除所有淀粉结合蛋白标签化(SBP-tagged)的残基。(即SBP_标 签化内切蛋白酶(SBP-taggedendoprotease)、SBP-标签化-目标蛋白(SBP-tagged target protein)及游离 SBP (free SBP))。图2表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)及植酸酶(Phytase)在水中的示意图。图3表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)在水中释放实验的结果。图4A-4C表示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(SBP-eGFP)结合至不同 类型树脂的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)的结果。图4A显示分枝淀粉 (amylopectin)的结果。图4B显示直链淀粉树脂(amyloseresin)的结果。图4C显示糊精 树脂(dextrin resin)的结果，其中，M 标记，In 流入物，P 结合蛋白，S 未结合蛋白。图5显示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(SBP-eGFP)结合至藻酸盐微粒 (alginate beads)的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)的结果，其中，M 标记， In 流入物，S 未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化重组蛋白的方法，其特征在于，包含：　　（ａ）提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白的溶液；　　（ｂ）添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质；　　（ｃ）抽提碱性缓冲液至步骤（ｂ）的第一容器以获得混合物；　　（ｄ）混合该混合物与溶液，该溶液是用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组蛋白以生成反应混合物；以及　　（ｅ）添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回收重组蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张大慈，许嘉钦，
申请(专利权)人：善笙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]