【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法。
技术介绍
1、羊魏氏梭菌病是由梭菌属(clostridium)中的多种细菌引起的一类急性传染病，能够引起的疾病有：羊猝疽、羊快疫、羊肠毒血症、羔羊痢疾和羊黑疫等。这5种疾病的症状非常类似，其相同特点是发病急、死亡快。羊痘病毒基因庞大，因此我们用羊痘病毒疫苗株作为载体，与魏氏梭菌抗原蛋白的免疫基因相结合，从而构建多价的重组病毒，使用这种重组病毒免疫羊只，可以同时保护羊痘病毒和魏氏梭菌对羊攻击，达到一苗多用的预防效果。
2、虽然目前魏氏梭菌疫苗可以有效的预防羊魏氏梭菌病的发生，但是注射魏氏梭菌疫苗成本高，周期长，程序复杂，很难在羊群中推广使用。为有效预防羊魏氏梭菌病，生产高效、简便、实用的疫苗非常必要。
技术实现思路
1、针对上述情况，本专利技术首次公开了一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法。
2、本专利技术包括以下技术方案：
3、一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，包括以下步骤：
4、1)选择魏氏梭菌α、β1、β2、ε的全长基因序列中抗原性较高的区域作为目的基因片段，分别设计引物进行pcr扩增，获得α、β1、β2、ε共4个高抗原性区域基因片段；
5、2)构建分别含有α、β1、β2、ε高抗原性区域基因片段的4个表达载体；
6、3)利用上述4个表达载体，采用融合pcr
7、4)羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组；
8、5)重组病毒的纯化与鉴定；
9、6)双报告系统的消除。
10、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，所述步骤1)中的α、β1、β2、ε高抗原区域基因片段的核苷酸序列分别如seq id no：1-4所示。
11、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，所述步骤1)中的引物序列p6-p13分别如seq id no：5-12所示。
12、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，所述表达载体分别为：pet-42b-α、pet-42b-β1、pet-42b-ε和pet-42b-β2。
13、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，步骤3)包括以下具体步骤：
14、(1).引物设计
15、为采用融合pcr的方法将α、β2、ε、β1四个基因高抗原性区域连接在一起，以构建的表达载体为模板，根据融合pcr的原理分别设计引物p14-p21，其核苷酸序列分别如seq idno：18-25所示，所述引物p15-p20中均含有link，所述link的核苷酸序列如seq id no：26所示。
16、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，步骤3)还包括以下具体步骤：
17、(2)目的基因pcr扩增融合
18、a、以构建的四个基因片段表达载体为模板，分别用引物p9/p10、p11/p12、p13/p14、p15/p16扩增四个基因片段，分别电泳回收，20μl扩增体系为：mix酶10μl，上下游引物各0.3μl，模板1μl，ddh2o 16.7μl；扩增程序为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，再延伸72℃10min，共循环35次；
19、b、四个基因预融合，以回收的四个pcr产物为模板，不加引物的情况下使四个基因片段预融合在一起：其产物电泳回收，得到α-β2-ε-β1融合基因；
20、20μl扩增体系为：mix酶10μl，四个回收产物模板各2μl，ddh2o 2μl；扩增程序为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃3min，再延伸72℃10min，共循环11次；
21、c、四个基因的正式融合：以预融合的产物为模板，用p9和p16引物进行扩增，20μl扩增体系为：mix酶10μl，模板各3μl，引物各0.3μl，ddh2o 7μl；扩增程序为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，再延伸72℃10min，共循环35次，pcr产物电泳回收；
22、(3)酶切：α-β2-ε-β1融合基因和pgm-tk13-i1l-msc-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp、pgm-tk13-p11-msc-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp，pgm-tk13-vv7.5-msc-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp载体均进行fsei和asci的双酶切，
23、50μl酶切体系为：载体和pcr产物分别为13μl和35μl，buffer各5μl，fsei各1μl，asci各1μl，ddh2o分别为30μl和8μl，混匀后于37℃水浴酶切3-4h，并对酶切产物进行回收纯化，于-20℃保存；
24、(4)连接
25、处理好的pcr产物及载体通过t4 dna连接酶进行连接，10μl体系：载体1μl，目的片段4μl，t4 dna连接酶1μl，10×t4 dna连接酶buffer 1μl，ddh2o 3μl，并设立空白对照(无目的片段，其余条件一致)；
26、(5)转化和鉴定
27、将各连接产物常规方法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂板培养，挑取单菌落振摇培养6-8h，以菌液为模板进行pcr扩增鉴定；
28、构建出魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘疫苗多价重组病毒的表达载体：pgm-tk13-i1l-α-β2-ε-β1-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp、pgm-tk13-p11-α-β2-ε-β1-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp和pgm-tk13-vv7.5-α-β2-ε-β1-loxp-gpt-vv7.5-7.5-gfp-loxp。
29、进一步的，上述一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，所述步骤4)羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组包括以下具体步骤：
30、(1)细胞制备：常规方法制备羊睾丸原代细胞；
31、(2)羊痘病毒疫苗株的培养：待羊睾丸原代细胞长好，接种山羊痘病毒疫苗株av41；
32、(3)病毒重组：将构建并测序正确的重组转移载体pgm-tk13-p11-α-β2-ε-β1-gpt-gfp用lip2000脂质体转染试剂转染转染至已经感染了山羊痘病本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的α、β1、β2、ε高抗原区域基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
3.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的引物序列P6-P13分别如SEQ ID NO：5-12所示。
4.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述表达载体分别为：pET-42b-α、pET-42b-β1、pET-42b-ε和pET-42b-β2。
5.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，步骤3)包括以下具体步骤：
6.根据权利要求5所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，步骤3)还包括以下具体步骤：>
7.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤4)羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组包括以下具体步骤：
8.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤5)重组病毒的纯化与鉴定包括以下具体步骤：
9.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤6)双报告系统的消除包括以下步骤：
10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备获得的羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的α、β1、β2、ε高抗原区域基因片段的核苷酸序列分别如seq id no：1-4所示。
3.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的引物序列p6-p13分别如seq id no：5-12所示。
4.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗的构建方法，其特征在于，所述表达载体分别为：pet-42b-α、pet-42b-β1、pet-42b-ε和pet-42b-β2。
5.根据权利要求1所述的一种羊魏氏梭菌抗原蛋白-羊痘病毒疫苗株重组多价疫苗...
【专利技术属性】
技术研发人员：李有文，周正国，赵垚鑫，张汐，王永飞，刘晓艳，邓博文，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：
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