【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程以及医药领域，特别涉及核糖核酸酶r领域，尤其是突变的核糖核酸酶r及其应用。本案是申请号为202211610204.8，专利技术名称为“一种突变的核糖核酸酶r及其应用”的分案申请。
技术介绍
1、核糖核酸酶r(rnase r)是一种依赖镁的3'→5'外核糖核酸酶，其基本上消化所有线性rna，但不消化套索状或环状rna结构，或比3'突出端短的双链rna 7个核苷酸。大多数细胞rna会被rnase r完全消化，但trna，5s rna和内含套索蛋白除外。套索的3'-尾巴将被rnase r修饰为分支点核苷酸，其中存在2'，5'-磷酸二酯键。
2、环状rna(circular rna，circrna)是区别于线性rna的一类新型环状非编码rna，半衰期长，具有物种保守性和组织特异性。其独特的环状结构使其不容易被rna酶降解，因此在细胞内稳定性很强，在新型生物标记、生物学机制研究等方向具有巨大的潜力和研究价值。
3、“circrna”这一概念最早出现在1971年，在rna病毒中被发现，但长期以来，由于其表达丰度很低，所以一直被认为是转录的“噪音”，没有实际作用。直到2012年，借助于高通量测序技术，salzman等(salzman j,gawad c,wang p l,et al.circular rnas are thepredominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse celltypes.plos on
4、随着环状rna的深入研究，环状rna制备问题就越来越备受关注。在环状rna制备过程中，为了消除其他rna的干扰，必须要用到rnase r对反应体系的其他rna进行消除，才能获得较纯的circrna。但是，目前已有的rnase r品质差别较大，在验证过程中发现某些rnase r对circrna有明显的降解作用。随着对环状rna研究的热度不断增加，未来市场和研究领域对于rnase r的需求会进一步增加。
5、cn114438054a(公开日期2022.05.06)公开了一种突变型rnase r被命名为rnaser_△m8，其氨基酸序列如seq id no.5所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如seq idno.6所示。该专利技术提供的突变型rnase r_△m8的制备过程包括载体构建、载体转化、蛋白诱导表达、细菌收集、蛋白纯化及活性测定等过程。与野生型rnase r相比，该专利技术提供的突变型rnase r的蛋白表达量更高，可以耐受150mm的nacl。
6、虽然现有技术中已有突变型rnase r，但本领域仍然存在亟需提供不同的、性能提升的突变的rnase r用于工业和科学研究，特别是酶活性提升的突变的rnase r，可获得产量和纯度更高的circrna。
技术实现思路
1、针对rnase r领域现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种性能提升的，特别是酶活相对于亲本显著提升的突变的rnase r。本专利技术进一步的目的是提供一种高表达核糖核酸酶rnase r的重组菌株，特别是重组大肠杆菌，用于实现rnase r突变体的高效生产，具有良好的工业应用前景。本专利技术还提供了编码所述突变的rnase r的重组核酸，包含所述核酸的表达盒、载体、细胞、菌株、组合物、试剂盒，以及rnase r突变体的制备方法、纯化方法、酶活检测方法，还有其在降解线性rna、生产circrna领域的应用等。
2、本专利技术的一方面提供一种突变的核糖核酸酶r，其特征在于，在亲本核糖核酸酶r的基础上包含突变，所述突变包含t495e，a246e，k457f，a246f，d281f，或d122l，所述亲本核糖核酸酶r的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、进一步地，所述突变的核糖核酸酶r为突变体t495e，a246e，k457f，a246f，d281f，或d122l，所述突变体t495e的氨基酸序列如seq id no:30所示，突变体a246e的氨基酸序列如seq id no:25所示，突变体k457f的氨基酸序列如seq id no:29所示，突变体a246f的氨基酸序列如seq id no:26所示，突变体d281f的氨基酸序列如seq id no:27所示，突变体d122l的氨基酸序列如seq id no:23所示。
4、进一步地，所述亲本核糖核酸酶r的dna序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术的另一方面提供一种重组核酸，其特征在于，包含编码所述突变的核糖核酸酶r的核酸。
6、本专利技术的另一方面提供一种表达盒，其特征在于，包含所述重组核酸。
7、本专利技术的另一方面提供一种载体，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒；优选地，所述载体为表达载体。
8、本专利技术的另一方面提供一种细胞，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒或所述载体。
9、本专利技术的另一方面提供一种重组菌，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒或所述载体；优选地，所述菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)、e.coli origami b(de3)或e.coli rosetta blue(de3)中的一种；最优选地，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)。
10、本专利技术的另一方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述突变的核糖核酸酶r或所述重组核酸或所述表达盒或所述载体或所述细胞或所述重组菌。
11、本专利技术的另一方面提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述突变的核糖核酸酶r或所述重组核酸或所述表达盒或所述载体或所述细胞或所述重组菌或所述组合物。
12、本专利技术的另一方面提供一种制备所述突变的核糖核酸酶r的方法，其特征在于，包括如下步骤：
13、(1)构建含有编码所述突变的核糖核酸酶r的核苷酸序列的载体；
14、(2)将步骤(1)获得的载体转化至表达菌株细胞中，获得表达菌株；
15、(3)将步骤(2)获得的表达菌株扩大培养并进行蛋白诱导表达；
16、(4)收集扩大培养后的表达菌株，并进行洗涤及裂解；
17、(5)进行蛋白纯化；
18、(6)进行酶活检测。
19、进一步地，所述步骤(3)包含将步骤(2)制备获得的表达菌株，在25-37℃下培养至od600为0.6-1.0，培养基中加入异丙基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种突变的核糖核酸酶R，其特征在于，在亲本核糖核酸酶R的基础上包含突变，所述突变为K457F，所述亲本核糖核酸酶R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的突变的核糖核酸酶R，其特征在于，所述突变的核糖核酸酶R为突变体K457F，所述突变体K457F的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。
3.根据权利要求1或2所述的突变的核糖核酸酶R，其特征在于，所述亲本核糖核酸酶R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组核酸，其特征在于，包含编码权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的核酸。
5.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸。
6.一种载体，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为表达载体。
8.一种细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体。
9.一种重组菌，其特征在于，包含权利要
10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于，所述菌为大肠杆菌。
11.根据权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli Origami B(DE3)或E.coli Rosetta Blue(DE3)中的一种。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
13.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R、或权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体、或权利要求8所述的细胞、或权利要求9-12任一项所述的重组菌。
14.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R、或权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体、或权利要求8所述的细胞、或权利要求9-12任一项所述的重组菌、或权利要求13所述的组合物。
15.一种制备权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的方法，其特征在于，包括如下步骤：
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包含将步骤(2)制备获得的表达菌株，在25-37℃下培养至OD600为0.6-1.0，培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.5mM，16-37℃下诱导发酵8-16h，即可诱导表达所述突变的核糖核酸酶R。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包含将步骤(3)获得的发酵液8000rpm离心5min并弃去上清液，之后用50mM的PBS重悬菌体并在8000rpm离心5min并弃去上清液，加入PBS重悬细胞，混匀；在冰上超声破碎细胞；将菌体破碎液放入预冷的离心机，4℃、8000rpm离心10min，收集沉淀，并将沉淀复溶于含有500mM的KCl缓冲液中。
18.一种权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的纯化方法，其特征在于，包含如下步骤：将发酵获得的包含所述突变的核糖核酸酶R的粗酶液，利用蛋白纯化系统对所述粗酶液进行镍柱纯化，使用预先用平衡液平衡的镍柱，以浓度递增的洗脱液洗脱，收集目标蛋白，再进行电泳分析检测。
19.一种权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的酶活检测方法，其特征在于，包含如下步骤：将所述突变的核糖核酸酶R通过一系列梯度稀释，将稀释后的所述突变的核糖核酸酶R在37℃条件降解10μg线性mRNA，1h后通过凝胶电泳检测，直到电泳检测无明显条带，根据无明显条带的酶的用量来计算所述突变的核糖核酸酶R的酶活。
20.权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R在mRNA制备领域中的应用。
21.权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R在降解线性RNA或生产circRNA领域中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种突变的核糖核酸酶r，其特征在于，在亲本核糖核酸酶r的基础上包含突变，所述突变为k457f，所述亲本核糖核酸酶r的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.根据权利要求1所述的突变的核糖核酸酶r，其特征在于，所述突变的核糖核酸酶r为突变体k457f，所述突变体k457f的氨基酸序列如seq id no:29所示。
3.根据权利要求1或2所述的突变的核糖核酸酶r，其特征在于，所述亲本核糖核酸酶r的dna序列如seq id no.2所示。
4.一种重组核酸，其特征在于，包含编码权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶r的核酸。
5.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸。
6.一种载体，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为表达载体。
8.一种细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体。
9.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体。
10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于，所述菌为大肠杆菌。
11.根据权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)、e.coli origami b(de3)或e.coli rosetta blue(de3)中的一种。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)。
13.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶r、或权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6或7所述的载体、或权利要求8所述的细胞、或权利要求9-12任一项所述的重组菌。
14.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶r...
【专利技术属性】
技术研发人员：左涛，刘立，汪芸，王鹏源，王满朝，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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