【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白及其应用。
技术介绍
1、白细胞介素-1(interleukin-1，il-1)是一类重要的促炎症细胞因子，当生物体受到创伤或发炎时，发炎部位的单核吞噬细胞会产生大量的il-1，与位于成纤维细胞和t细胞等细胞表面的受体结合，刺激信号传导和细胞活化。这种相互间的作用导致了多细胞间反应，如促进骨髓释放中性粒细胞，诱导单核细胞和多核粒细胞趋化浸润到炎症局部，在局部释放溶酶体酶。il-1还引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质。
2、白细胞介素-1家族主要包括il-1α和il-1β和il-1受体拮抗剂(il-1ra)，il-1ra可与il-1r1受体结合，但并不刺激信号传导不引起下游通路的激活，是一种内源性的抗炎症细胞因子，它是促炎症细胞因子il-1α和il-1β的天然特异性拮抗剂。il-1ra可阻断il-1的促炎作用，包括前列腺素e2和il-6从内皮细胞的释放、发热、血小板增多、肝脏急性期蛋白的产生以及中性粒细胞的扩张和浸润。
3、美国安进(amgen)公司生产的阿那白滞素(anakinra)，一种基因重组的il-1ra，已经于2001年9月14日被美国国家药品食品管理局(fda)批准用于改善中度及重度活动性类风湿性关节炎患者的症状和体征，减慢关节炎损害的进展。该药适用人群为年龄≥18岁、经一种或一种以上抗类风湿药物治疗无效的类风湿性关节炎患者。anakinra与天然的il-1ra相比最主要的区别在于：(1)它是非糖基化蛋白；(2)它的
4、因此，现有技术有待于进一步发展。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服上述技术不足，提供一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白及其应用，以解决相关技术中重组白细胞介素-1受体拮抗剂药物半衰期短，患者用药频繁的技术问题。
2、为达到上述技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：提供了一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，融合蛋白由白细胞介素-1受体拮抗剂和白蛋白的纳米抗体通过连接肽偶联而成。白细胞介素-1受体拮抗剂如seq id no.3中所示，其氮末端比天然il-1ra多一个甲硫氨酸。本专利技术的可结合人血清白蛋白的纳米抗体(anti-has nanobody)是经羊驼免疫、噬菌体技术筛选及人源化改造优化后所得，该单域抗体可与人血白蛋白高亲和力结合的特性。
3、进一步地，连接肽为通式[glyglyglyglyser]n，其中n为1-4的整数。连接肽(linker)是由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性连接肽，该连接肽主要起到最大程度调整两端蛋白活性的作用。
4、优选地，连接肽为glyglyglyglyser。
5、本专利技术中通过构建il-1ra-linker-anti-hsa nanobody或anti-hsa nanobody-linker-il-1ra融合蛋白，通过不同的偶联策略，验证il-1ra-linker-anti-hsa nanobody两个功能基团的亲和力和活性，优选的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。其中seq id no.1组成如下：il1ra-ggggs-vhh15，seq id no.2组成如下：vhh15-ggggs-il1ra，其中vhh15是经过一系列筛选优化得到的可与人血白蛋白特异性结合的人源化纳米抗体。
6、本专利技术中编码白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的核苷酸采用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
7、本专利技术还提供了载有白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白核苷酸序列的载体。将目标蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去，所用标准的分子克隆过程见(j.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。
8、本专利技术还提供了载有白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白核苷酸序列的宿主细胞，宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌的细胞。细菌细胞包括革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的物种的细胞，革兰氏阴性细菌的细胞例如埃希氏杆菌属和假单胞菌属的细胞。真菌细胞包括酵母细胞例如酵母菌属(saccharomyces)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)和多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)。昆虫细胞包括果蝇的细胞和sf9细胞。植物细胞包括来自于作物植物例如谷类、药用和观赏植物或鳞茎的细胞等。适合用于本专利技术的哺乳动物细胞包括上皮细胞系(猪等)、骨肉瘤细胞系(人类等)、成神经细胞瘤细胞系(人类等)、上皮癌(人类等)、神经胶质细胞(鼠类等)、肝细胞系(猴等)、cho细胞(中华仓鼠卵巢)、cos细胞、bhk细胞、hela细胞、911、at1080、a549、293或per.c6、人类ecc ntera-2细胞、mesc细胞系的d3细胞、人类胚胎干细胞例如hs293和bgv01、shef1、shef2和hs181、nih3t3细胞、293t、reh和mcf-7和hmsc细胞。融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态细胞等。成功转化的细胞，即含有本专利技术dna构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取dna，然后pcr方法鉴定。或者，细胞培养清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗vhh或抗il-1ra抗体检测。
9、本专利技术的药物组合物，包括上述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白、载体、宿主细胞和制药学上可接受的载体或添加剂。本专利技术中的融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们需无菌且无致热原。药物制剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与具有一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于5％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓿瓶，西林瓶或预充注射器中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。
10、本专利技术提供了通过上述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白、载体、宿主细胞和药物组合物在制备用于治疗因白细胞介素1升高而导致的疾病药物中的应用。
11、本专利技术的融合蛋白可用于因白细胞介素1升高而导致的直接引起或间接导致或协同参与的疾病包括但不限于以下疾病：关节炎、结肠炎、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由白细胞介素-1受体拮抗剂、连接肽和白蛋白的纳米抗体三部分组成。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，并且所述连接肽为通式[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1-4的整数。
3.根据权利要求2所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为GlyGlyGlyGlySer。
4.根据权利要求3所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：白细胞介素-1受体拮抗剂-连接肽-白蛋白的纳米抗体以及白蛋白的纳米抗体-连接肽-白细胞介素-1受体拮抗剂，其序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
5.编码权利要求1所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的核酸。
6.一种载体，其特征在于，载有能够表达权利要求5所述核酸的载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，载有权利要求6所述载体的宿主细胞。
8.一种药物组合物，包括权利要求1-4任一项所述的白细
9.根据权利要求1-4任一项所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞和权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗因白细胞介素1升高引起疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中因白细胞介素1升高而导致的疾病包括：类关节炎、结肠炎、类风湿关节炎、肉芽肿性肺病、克罗恩病、周期性发热综合征、痛风急性发作、IL-1受体拮抗剂缺乏症、复发性心包炎、斯蒂尔病、自身免疫病。
...【技术特征摘要】
1.一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由白细胞介素-1受体拮抗剂、连接肽和白蛋白的纳米抗体三部分组成。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，并且所述连接肽为通式[glyglyglyglyser]n，其中n为1-4的整数。
3.根据权利要求2所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为glyglyglyglyser。
4.根据权利要求3所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：白细胞介素-1受体拮抗剂-连接肽-白蛋白的纳米抗体以及白蛋白的纳米抗体-连接肽-白细胞介素-1受体拮抗剂，其序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
5.编码权利要求1所述的白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的核酸。
【专利技术属性】
技术研发人员：邓磊修，纪王双，曲莉莉，
申请(专利权)人：山东百迈吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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