【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及乳酸趋向蛋白rlact或其基因在肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
1、化学趋向性是各类原核生物、真核细胞或者多细胞生物根据环境中化学物质的浓度梯度进行有向运动的现象。细菌趋向性主要由细胞膜外信号感受蛋白感受信号，再通过胞内信号传导，实现鞭毛旋转，从而实现细菌趋向性运动。
2、大肠杆菌nissle 1917(简称ecn)是一种革兰阴性益生菌。ecn是dr.alfrednissle在第一次世界大战期间分离出来，ecn作为兼性厌氧菌可在肿瘤区聚集。目前的研究证明：大肠杆菌ecn对血清敏感，不会产生任何与致病性大肠杆菌菌株相关的肠毒素或细胞毒素，ecn血清敏感的特征可以确保该菌株从正常器官中被快速清除，并且对患者无免疫毒性副作用；ecn的细胞外k5囊，对粘附和定殖很重要。据研究，细菌在实体肿瘤中优先增殖，这一特性使ecn靶向肿瘤，在肿瘤微环境中优先生长。
3、大肠杆菌的趋化性系统感知环境中化学物质的浓度变化，调节自身运动状态以获取有利的营养物质或躲避对细菌有毒的代谢产物。氨基酸和糖是大肠杆菌主要的引诱剂。大肠杆菌通过趋化受体蛋白来检测化学引诱剂，通常每个受体蛋白都能检测到一种或多种化合物。大肠杆菌有2个趋化性受体蛋白tar和tsr感应氨基酸，这2个受体蛋白分别对天冬氨酸和丝氨酸有选择性，可以感应到环境中微摩尔量的天冬氨酸和丝氨酸。大肠杆菌趋化蛋白的胞质信号域部分与chew、chea蛋白结合形成三元信号复合物，这些蛋白通过变构相互作用使信号放大，促使细胞对环境中引诱物浓度的微小变化做出反
4、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)是一种可定植于胃内强酸性环境的革兰阴性细菌。幽门螺旋杆菌选择性地在胃上皮定植感染宿主，并能在宿主的胃中存活数年。与大部分细菌不同，幽门螺旋杆菌不仅能耐受胃部强酸性环境，而且具有酸性环境的趋化性。与野生型幽门螺杆菌相比，非运动型或非趋化型突变体在胃粘膜的定殖能力较差，并且不能实现完全感染。
5、大肠杆菌与幽门螺杆菌在化学趋向信号传递方面部分相似。都以活塞式的蛋白质构象变化将化学信号从胞外配体结合域经过跨膜区域传递到胞内胞质信号域，通过chew介导chea的活性，通过chey的磷酸化程度影响鞭毛马达的运行。幽门螺杆菌也通过化学感受蛋白的甲基化程度来反馈控制chea的活性。但是幽门螺杆菌缺少了甲基化控制蛋白cher、cheb、ched，转而使用chew与chey的融合蛋白chevs来控制化学感受蛋白的甲基化。
6、通过对幽门螺旋杆菌全基因组序列分析，已经鉴定出四种化学感受器:tlpa,tlpb,tlpc和tlpd。2017年，文献报道了与幽门螺杆菌tlpc蛋白与小分子乳酸结合的晶体结构，乳酸与膜近端亚域结合。根据电子密度图的分析和配体结合口袋的化学性质的研究，确认配体为乳酸盐。通过对结合位点位置诱变实验，进一步证实tlpc介导幽门螺杆菌乳酸趋向性。tlpc蛋白拥有dcache结构域，通过膜近端部分直接识别配体乳酸分子。乳酸趋向性可能是幽门螺旋杆菌适应胃部酸性环境的原因。
7、这对特定肿瘤内环境的深层渗透为实现更有效的治疗提供了巨大潜力。乳酸主要由生长在实体瘤深部的代谢旺盛的肿瘤细胞产生，这就形成了肿瘤深部与血管距离越远，乳酸水平越高的特点。乳酸是肿瘤重要的代谢特征，因此具有乳酸趋向性的合成生物学元件在肿瘤的治疗中具有重要的应用潜力。
8、大肠杆菌没有乳酸趋化性，大肠杆菌也没有乳酸趋向性受体蛋白和乳酸趋向系统。由于胞内化学感受蛋白甲基化控制方式不同，推测幽门螺杆菌乳酸受体蛋白tlpc的膜内部分应与大肠杆菌丝氨酸趋向性受体蛋白tsr的膜内部分有差异。本专利通过将幽门螺杆菌tlpc的膜外乳酸结合域与大肠杆菌tsr的膜内胞质信号域形成融合蛋白，并考察融合蛋白的不同跨膜区域组合，创建了一种大肠杆菌乳酸趋化元件rlact，在菌体内组装后，能赋予大肠杆菌等没有乳酸趋化性的细菌乳酸趋化性。通过趋向肿瘤，实现肿瘤靶向治疗的目的。
技术实现思路
1、本专利技术通过将幽门螺杆菌tlpc的膜外乳酸结合域与大肠杆菌tsr的膜内胞质信号域形成融合蛋白，并考察融合蛋白的不同跨膜区域组合，创建了一种大肠杆菌乳酸趋化元件rlact，在菌体内组装后，能赋予大肠杆菌等没有乳酸趋化性的细菌乳酸趋化性。
2、本专利技术所述细菌除了大肠杆菌还可以是伤寒沙门氏菌，芽孢杆菌和李斯特菌。
3、本专利技术的目的是通过基因重组，赋予大肠杆菌等没有乳酸趋化性的细菌具有乳酸趋化性。
4、本专利技术的另一目的是构建新的乳酸趋化元件，能够将乳酸浓度信号，转化为大肠杆菌鞭毛运动的信号，使工程菌向乳酸浓度高的区域运动。
5、本专利技术构建乳酸趋化元件以及乳酸趋向工程菌的主要步骤包括：
6、1.乳酸趋化元件的构建
7、将tsr蛋白的跨膜部分序列和胞内结构域与tlpc的跨膜部分区域和膜外配体结合域融合，获得嵌合蛋白及其基因。乳酸趋向元件的是由幽门螺旋杆菌乳酸结合域与受体菌中化学趋向性受体蛋白嵌合而成。具有与乳酸结合，能将乳酸信号传递到鞭毛上，以介导鞭毛改变其旋转模式，进而促进细胞改变其泳动方向，趋向乳酸泳动。
8、将rlact基因与表达载体重组，获得表达rlact基因的质粒。载体可以是使用t7启动子的表达质粒，也可以使用天然或者人工合成乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、ptrc等能够在菌体内启动基因转录。
9、2.受体菌的改造
10、删除大肠杆菌的两种氨基酸感受蛋白。为了减少受体菌自身化学趋向系统的影响，将与tlpc有部分同源性的氨基酸受体蛋白tsr和tar敲除。
11、3.乳酸趋向元件表达菌株的获得
12、将rlact基因表达质粒转化入tsr和tar敲除菌株，筛选正确的乳酸趋向元件表达菌株。敲除可以通过同源重组的方式进行，也可以通过crispr技术、red/et重组工程等新技术提高基因敲除和编辑效率。
13、4.重组菌株乳酸趋向性的功能验证
14、进行乳酸趋化验证实验，使用野生型菌株为阴性对照，与rlact基因表达工程菌进行实验。证明重组菌株具有乳酸趋向性；证明乳酸趋向性元件具有功能。实验可以采用半固体培养基，考察工程菌趋化运动能力；也可以采用液体培养基测定菌趋向高浓度乳酸的数量，确定乳酸趋向能力。
15、本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
16、本专利技术使得原本不具备乳酸趋化性但是十分安全的ecn获得了乳酸趋化性，为其在高乳酸浓度的肿瘤微环境中的应用打下基础。
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1.一种乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，所述乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因赋予没有乳酸趋向性细菌获得乳酸趋向性。
2.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，所述的编码基因是rLact-1基因序列，Sequence ID Number 1，以及rLact-2基因序列，Sequence IDNumber3。
3.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，基因编码的蛋白质序列分别为rLact-1蛋白序列，Sequence ID Number 2，以及rLact-2蛋白序列Sequence ID Number 4。
4.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，将幽门螺杆菌TlpC的膜外乳酸结合域，Sequence ID Number 5，以及跨膜区1和2，Sequence IDNumber6,7，与大肠杆菌Tsr的膜内胞质信号域，Sequence ID Number 8，融合形成融合蛋白。
5.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或
6.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，所述没有乳酸趋向性细菌，包括大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、芽孢杆菌、李斯特菌。
7.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因，其特征在于，表达嵌合蛋白后的细菌向乳酸浓度高的区域富集。
8.权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rLact或其编码基因在制备肿瘤治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种乳酸趋向蛋白rlact或其编码基因，其特征在于，所述乳酸趋向蛋白rlact或其编码基因赋予没有乳酸趋向性细菌获得乳酸趋向性。
2.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rlact或其编码基因，其特征在于，所述的编码基因是rlact-1基因序列，sequence id number 1，以及rlact-2基因序列，sequence idnumber3。
3.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rlact或其编码基因，其特征在于，基因编码的蛋白质序列分别为rlact-1蛋白序列，sequence id number 2，以及rlact-2蛋白序列sequence id number 4。
4.根据权利要求1所述的乳酸趋向蛋白rlact或其编码基因，其特征在于，将幽门螺杆菌tlpc的膜外乳酸结合域，sequence id number 5，以及跨膜区1和2，sequence id...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪现朴，丁一，苏子昂，林嘉英，杨张毅，李梦婷，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：
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